【毕业学位论文】（Word原稿）鸡SIgA检测方法建立及禽流感-新城疫重组二联活疫苗诱导局部黏膜免疫的研究预防兽医学硕士学位论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 鸡 测方法建立及禽流感 二联活疫苗诱导局部黏膜免疫的研究 of on to 5 in of on to 5 in I 摘 要 禽类黏膜免疫作为机体抵御病原体感染的第一道免疫屏障具有重要意义。黏膜免疫的主要效应因子为 黏膜表面阻止病原菌的粘附、增殖，启动免疫学生物活性，清除病原，保护机体抗感染等方面发挥重要作用。 本研究重组表达了鸡 链片段蛋白，分离纯化后免疫 c 小鼠，并以鸡胆汁中分离纯化的 为检测抗原，筛选出 1 株能够稳定分泌抗鸡 克隆抗体的杂交瘤细胞株型鉴定显示该单克隆抗体为 型；经间接 证，所 获得的 1 株单克 隆抗体具有 高度亲和力和特异性，为开展家禽黏膜免疫机制的研究提供了重要技术手段。 在此基础上，用生物素标记纯化 抗腹水 建立了新城疫病毒 （ 及 型禽流感病毒 （ 异黏膜 法。 利用这一方法，对 流感病毒 原重组 疫苗 （ 免疫 局部黏膜特异性 疫反应进行了研究。 结果， 鸡采用 滴鼻点眼途径一次免疫，口腔 周，可检测到 异 疫反应；免疫后 3 周能检测到低水平的 异 疫反应， 应明显滞后于 异 别于免疫后 3 周和 4 周迅速降至接近免疫前背景水平；小肠分泌液分别于免疫后 4周检测到明显的 5 异 显滞后于口腔 两种 体水平均显著高于口腔 成鸡采用 滴鼻点眼途径间隔 16 周二次加强免疫，口腔 5 异 平较一次免疫雏鸡反应明显提高，分别于免疫后一周即可检测到 异 显著增强免疫反应， 2 周后达到高峰， 3 周后迅速降至接近加强免疫前背景水平；小肠黏膜分泌液中 异 应时相与口腔 体高峰出现不再表现滞后，但两种 体水平同样显著高于口腔 结果表明， 重组 载体疫苗 疫后，可有效诱导上呼吸道及消化道黏膜 5 原特异性 疫反应；同呼吸道相比，消化道具备更为强大的黏膜 次免疫鸡呼吸道黏膜再次接触到感染性 毒抗原，可形成显著的特异性 强免疫反应 ; 重组活载体疫苗诱导 异黏膜 应具有启动快速、持续时间短暂的特点。 上述结果部分阐明重组新城疫活载体疫苗 免疫保护机制，并对应用免疫程序的合理制定具有重要指导意义。 关键词： 新城疫病毒， 型禽流感， 重组新城疫活载体疫苗 of is as of in ( to of in to In to c A 1. 1 1 is to on gG 1, 5 to of to 5 DV of PF of 1 106 5 be in 5 to In DV 5 be in DV 5in of PF of 11066 DV 5 be in DV 5 of DV 5 to in or DV 5 A in in to DV 5in to -4 of DV ; H5 录 第一章 绪 论 . 1 类黏膜免疫 . 1 禽黏膜系统的组成 . 1 禽黏膜免疫系统的特点 . 2 禽黏膜免疫系统的功能 . 3 禽黏膜免疫反应 . 3 禽黏膜免疫在抗感染中的作用 . 4 苗与黏膜免疫的关系 . 5 期黏膜免疫对免疫器官的激活和启动作用 . 5 源抗体与黏膜免疫 . 5 城疫概况 . 6 流感概况 . 6 流感、新城疫重组二联活疫苗 . 7 文主要研究内容及目的意义 . 7 第二章 研究内容 . 9 料和方法 . 9 粒、菌种与细胞 . 9 要试剂与材料 . 9 验动物及免疫用疫苗 . 9 核表达质粒 . 9 核表达重组 链蛋白 . 10 组 链蛋白的纯化 . 10 胆汁中 提取与鉴定 . 11 物免疫 . 12 链单克隆抗体的制备 . 13 克隆抗体腹水制备 . 15 克隆抗体的鉴定 . 15 鸡 链单抗腹水中 体的提取 . 16 物素标记单克隆抗体 . 16 测方法的建立及反应条件的优化 . 16 物免疫试验 . 17 果 . 18 核表达重组质粒 链酶切鉴定结果 . 18 核重组 链蛋白的表达 . 18 汁中 离纯化、 定 . 19 接 定鼠抗 链特异性多克隆抗体效价 . 21 原包被最佳浓度与阴、阳性血清最佳稀释度的确定 . 22 性杂交瘤细胞株的筛选 . 22 克隆抗体特异性鉴定 . 22 V 抗细胞上清及腹水效价测定 . 23 克隆抗体亚型鉴定 . 24 抗腹水中 纯化结果 . 24 物素标记抗体工作浓度的确定 . 25 记抗体的交叉反应试验 . 25 被抗原的最适浓度确定 . 26 清样本最佳稀释度的确定 . 27 组病毒初次免疫 鸡的系统体液免疫和局部黏膜免疫 . 27 组病毒二次免疫 成鸡的系统体液免疫和局部黏膜免疫 . 32 论 . 37 于鸡 提取 . 37 于免疫用抗原的制备 . 37 于单克隆抗体的制备 . 37 于单克隆抗体纯化技术 . 38 于生物素标记抗体技术 . 38 于间接 测方法 . 39 于 苗株诱导的黏膜免疫 . 39 第三章 全文结论 . 43 参考文献： . 44 致谢 . 47 作者简介 . 48 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 s s 尔伯克改良伊格尔培养液 黄嘌呤与胸苷 嘌呤、氨基喋呤与胸苷 丙基 43乙二醇 城疫病毒 流感病毒 苄青霉素 酸盐缓 冲溶液 二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,4硫苏糖醇 二胺四乙酸 酸缓冲溶液 酸纤维素 苯二胺 甲基亚砜 联免疫吸附测定 免疫球蛋白 G 免疫球蛋白 M 分泌型免疫球蛋白 A 0% 胚半数感染量 特定病原体 血清白蛋白 A 凝素 凝抑制反应 疫球蛋白 记亲和素 和素 牛血清 B 液体培养基 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 类黏膜免疫 黏膜是免疫的主要屏障 (., 2001)。 在机体正常状态下，黏膜是预防病原体的主要屏障；在黏膜病理状态下，黏膜屏障便不具有免疫反应的能力，病原微生物和它们的有毒产物就会进入体内，产生有害的影响 (M et 1997)。目前，家禽黏膜免疫已引起了相关研究人员的日益重视，并成为了当前生物医药研究领域的又一热点 (王世若 等， 2001)。家禽黏膜免疫系统是机体免疫系统不可分割的重要组成部分 ，也是免疫系统的第一道防线（杨淑静，2001） 。研究已经证实，机体 95 以上的感染发生在黏膜或由黏膜入侵机体，同时黏膜既存在局部免疫又存在共同免疫系统，使黏膜免疫细胞相对独立于系统免疫 (高英杰 ， 2000)。此外，黏膜免疫系统对黏膜表面不时吸入或食入的大量种类繁杂的抗原，可进行准确识别和作出迅速正确的反应，对有害抗原或病原体产生高效的体液和细胞免疫，从而进行有效的免疫排斥或排除。虽然黏膜免疫系统处于大量繁杂抗原的包围中，但黏膜免疫抑制状态有利于机体的自稳和平衡，因而黏膜免疫是机体一种重要的保护机制。家禽黏膜免 疫研究对家禽相关疾病的防治及有效黏膜疫苗的研究均有着十分积极的意义。 禽黏膜系统的组成 家禽黏膜系统由家禽胃肠道、呼吸道及某些外分泌腺 (哈德尔腺、盲肠扁桃体等 )黏膜相关淋巴组织构成 (F et 1996)。禽的黏膜系统是一个相对独立的系统，根据功能和分布的特点将黏膜系统分成两个部分：一是黏膜相关淋巴组织，包括黏膜的集合淋巴小结、膜细胞、囊淋巴滤泡组织、肠相关淋巴组织、盲肠扁桃体、胸腺依赖淋巴组织、淋巴细胞聚合体。二是弥散型免疫细胞，包括上皮内淋巴细胞 (固有层 淋巴细胞 (皮下巨噬细胞、固有层 有层肥大细胞、抗原递呈细胞 (文其乙 等， 2000)。 黏 膜免疫的过程大致如下：黏 膜结合淋巴组织 (外界抗原接触后将抗原摄取，淋巴组织中的辅助细胞提呈抗原，将组织中的 淋巴细胞致敏。致敏的 通过胸导管进入血液循环，进而到达全身各处的 黏 膜组织，在那里 殖成熟为 et 1983） 。 黏 膜免疫系统的免疫反应既有体液 免疫，又有细胞免疫。起主要作用的是体液免疫因素，其抗体主要是分泌型 占 黏 膜组织所产生抗体的 80%以上 (N. K et 1992)。 发挥免疫作用的免疫细胞主要有以下两类： （ 1) 家禽黏膜诱导部位的免疫细胞。家禽黏膜诱导部位包括集合淋巴结和腹腔淋巴结。诱导位点为首次接触抗原并诱导起始反应的位点，主要有一些黏膜相关的淋巴组织 (包括肠道相关淋巴组织 (支气管相关淋巴组织 (近年来发现的眼结膜相关淋巴组织( M 细胞。在 膜诱导部位的免疫细胞主要有上皮细胞、 M 细胞、巨噬细胞和树突状细胞。上皮细胞在黏膜表面的功能主要包括：产生大中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 量黏膜免疫调节细胞因子；表达几种细胞受体；通过肠道杯状细胞生成三叶状蛋白来保护上皮细胞免受外部损害；从基底面摄取 经细胞转运作用达到顶端表面进入肠腔中；肠上皮细胞还具有抗原摄取、加工与提呈功能 ( et 1983)。 M 细胞主要功能是摄取并转运抗原至其下组织，尤其是颗粒性抗原。 M 细胞是 构成大分子物质非受体转运的主要生理途径。巨噬细胞主要提呈细菌与细胞膜成分。树突状细胞 (唯一的能激活纯贞 要提呈一些肽片段 (王 华 ， 2000)。 （ 2) 黏膜效应部位的免疫细胞。黏膜效应位点包括肠道、呼吸道、生殖道等黏膜的固有层及一些腺体。黏膜效应部位的免疫细胞主要有位于固有层的淋巴细胞 (位于上皮内基底膜之上的上皮内淋巴细胞 ( 0 90 为 中约 65 80的 细胞也为细胞。 固有层 T 细胞能促进 活的固有层淋巴细胞可表达高水平的 、 、 等细胞因子；诱导 性，产生细胞毒 80 90 的 中 80为 T 细胞 (文其乙 等， 2000)。 有组成性溶细胞活性，这是机体针对病原体入侵及上皮细胞变性所作出的快速反应机制；具有辅助活性，可产生与 而具有调节其他淋巴细胞和上皮细胞功能的特性；能够刺激上皮 细胞更新；产生对食物抗原的耐受 (王 华 ， 2000)。 禽黏膜免疫系统的特点 第一，具有独特的结构特点。家禽黏膜免疫系统的组织结构有别于系统免疫系统，其特点是大量免疫细胞和免疫分子弥散在黏膜上皮内及黏膜下 (侯振中 等， 2001)。或由单个或多个淋巴滤泡聚集成滤泡结节，如 肠扁桃体及大量外分泌腺构成黏膜相关淋巴组织(包括位于胃肠道以集合淋巴结和小的孤立淋巴结为代表的肠相关淋巴样组织 (位于上呼吸道的支气管淋巴样组织 (鼻黏膜 (，构成家禽黏膜免疫系统 (张永振 ， 2001)。已知黏膜部位的免疫细胞和免疫分子数量均超过系统免疫，使黏膜免疫系统成为机体最大的免疫器官（ 王彩虹 等， 2001） 。第二，有特异的免疫分子介导免疫反应和细胞归巢。家禽黏膜免疫系统具有特异的免疫分子和独特细胞群 ( et 1979)。 分泌细胞数量及抗体量均大大超过 et 2002)。 过 C(以受体介导方式及黏膜上皮或基底膜表达的 导该结合物的内吞，并转运至细胞的顶膜，经酶解，使结合有 分泌至黏膜腔 ( et 2002)。黏膜表面 阻止病原体 的黏附及入侵，胞内转运过程中的 et 1999)。免疫细胞在黏膜的移行与归巢，也是在特异的黏附分子、趋化因子及受体介导下进行的。在黏膜诱导部位，致敏的淋巴细胞经 导管进入血 循环，然后在黏膜特异归巢分子及黏附分子的作用下，归巢至黏膜固有层和上皮内。归巢过程涉及趋化因子及其受体的表达 ( et 1996)。第三，有特异的免疫细胞介导和调节黏膜免疫 (.G et 2004)。微褶细胞 (M 细胞 )、上皮内淋巴细胞 (肠黏膜上皮细胞 (三类免疫细胞具中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 有各自独特的性质，在家禽黏膜免疫系统中起着介导和调节黏膜免疫的重要作用 ( et 2000)。 M 细胞位于 膜上皮细胞问，其顶面对黏膜腔，其基底膜向顶部呈穹隆状突起，形成口袋，内充满 细胞及少数巨噬细胞。 M 细胞表面有类似 集素）的结构，以受体介导的方式选择性地采集病毒和细菌等抗原，使抗原直接与袋内的免疫细胞相接触，缩短了吞噬泡穿膜的距离 ( et 2001)。 M 细胞的主要功能是摄取和转运，成为黏膜免疫系统的门户，是启动黏膜免疫应答的第一步。 过基底膜沿其成为第一个与黏膜表面抗原接触的免疫细胞。每 5 10个肠上皮细胞中间就有一个 体内数量最多的免疫细胞，主要为 T 细胞，且细胞占 80 以上。具有溶细胞活性 为早期抗感染机制作用于病原体。 胞的更新和移行。 面有各种防御分子如 趋化因子等。 可以通过其基底膜的孔隙与黏膜固有层中的不同免疫细胞亚类紧密接触。 与经典 然表达 分子，但 类分子的递呈途径受抑，主要依赖激活 T 细胞产生免疫抑制反应。 递呈小肽、非肽类糖和脂类抗原 ( et 2005)。总之， 在多种 抗原递呈分子和共刺激分子。此外， 禽黏膜免疫系统的功能 家禽黏膜免疫系统的功能主要有以下几个方面：一是与一些非特异因素一起保护宿主不受病毒的侵害。这些非特异性保护因素包括：正常菌群 (大量寄居在肠道中的非致病微生物，可以抑制病原菌的生长 )，黏膜的机械运动，黏膜中存在着的一些不利于微生物生长的因素 (如胃酸和胆盐 )、黏性分泌物 (如多黏蛋白复合物 )、微生物抑制物 (.G et 1989)。二是对饲料中大量的抗原及肠道的菌群产生 免疫耐受，以防止系统与抗原之间不必要的接触和过敏反应。当黏膜免疫不健全时，机体发生感染，出现过敏反应和自身免疫 (.E et 1993)。 禽黏膜免疫反应 家禽黏膜免疫由于黏膜部位共有复杂和特异的抗原环境，相对系统免疫 (体液免疫、细胞免疫 )而言，具有其自身的一些特点。一是免疫球蛋白以分泌型 主；二是黏膜部位有特异的具有调节或效应功能的 是黏膜细胞运输系统使局部黏膜淋巴滤泡中受抗原诱导后的淋巴细胞经循环系统分布到广泛的弥散淋巴组织中发挥效应 (侯振中 ， 2002)。家禽黏膜免疫系统成为了一个相对独立的免疫系统。 家禽黏膜免疫是区别于全身免疫的局部免疫。黏膜免疫的基础是家禽胃肠道、呼吸道等处存在着 大量的淋巴样组织构成完整而普遍的家禽黏膜免疫系统 (余保平 ， 2000)。在家禽黏膜系统中，富含着大量功能不同的免疫活性细胞，当病原体与之接触后即被吸收，并诱生 细胞应答。随后，特异性淋巴细胞游走并聚居于各种效应部位 (如黏膜固有层和腺体 )，应答由 第一章 绪论 4 子调节，并导致浆细胞分化和外分泌中产生大量 含量占黏膜相关组织产生所有抗体的 80 以上，从而导致局 部免疫保护作用 ( et 1983)。 黏 膜免疫反应中既有体液免疫，又有细胞免疫，两者以体液免疫为主，体液免疫的主要抗体是 （ ） 上皮细胞的细胞膜内与分泌成分 (合形成 过上皮细胞的囊泡运送释放入肠腔等 黏 膜表面 ( et 1998)。分泌物中的 分别有 4个和 8个抗原结合部位 )，多聚体比单体有更强的中和病毒的能力，多聚体的多价性比单体对细胞的凝集作用更强 ( et 1995)。 等。 白分解酶不能将其分解 (.K et 2001)。 膜表面可抑制微生物的粘附和阻止抗原从 黏 膜表面侵入机体，与抗原反应后不激活补体，所以并不引起炎症反应 (.I et 2003)。 膜表面与抗原反应形成的免疫复合物可激活补体，引起局部的炎 症反应(.N et 1999)。另外， 在没有可测到的血清