高效液相色谱法在中药制剂分析中的应用研究【毕业论文,绝对】.doc

学院编码：136060802学 号：0801060207 吉 林 农 业 大 学 发 展 学 院 毕 业 设 论 文 高效液相色谱法在中药制剂分析中 的应用研究 学 院：生 物 食 品 学 院 专 业： 中 药 学 班 级： 二 班 姓 名： 指导教师： 职 称： 讲 师 年 5 月 31 日l 高效液相色谱法在中药制剂分析中的应用研究【摘要】高效液相色谱广泛应用在中药化学成分研究方面，在中药制剂分析中的应用也越来越深入。本文从高效液相色谱技术的类型及发展近况及其在中药制剂分析中的应用研究两个方面进行了论述，为进一步研究高效液相色谱法在中药制剂分析中的应用提供理论数据。【关键词】 高效液相色谱法 中药制剂分析 应用研究lHigh performance liquid chromatography analysis of traditional Chinese medicine preparations ApplicationAbstract High performance liquid chromatography is widely used in Chinese medicineresearch on the chemical constituents in traditional Chinese medicine preparation analysisof more and more in-depth. In this paper the type of high performance liquidchromatography and Recent Developments in Chinese medicine preparation analysis oftwo aspects were discussed for further study of traditional Chinese medicine preparationsby high performance liquid chromatography analysis to provide theoretical data.Keywords: HPLC traditional Chinese medicine preparation analysis applied researchl 目 录前 言 11.高效液相色谱技术的类型及发展近况 22高效液相色谱法在中药制剂分析中的应用研究 32.1 测定中药制剂有效成分含量 32.2 测定中药制剂有效部位含量 32.3 在杂质检查中的应用 42.4 在中药复方制剂质量测检方面的应用 52.5 在中药复方制剂指纹图谱研究中的应用 52.6 在中药配伍中的应用 62.7 在中药复方的药动学研究中的应用 6小 结 8致 谢 9参考文献 10英文原文 12中文译文 17l 前 言 简 高效液相色谱法 High performanliquid chromatography， 称 HPLC是世纪 70 年代迅速发展起来的一种高效、速、高选择性、高灵敏度 的新型分离分技术，是经典液相色谱的发展 。高效液相色谱法在药物分析中的应主要鉴别相关物 质、检 查药物中有关质的含量限度 ，测定有效成分 或 主 要 成含量。高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。中药制剂分析是以中医药理论为指导采用现代分析理论和方法研究中药、中药制剂及其关联产品质量的一门综合性学科.由于中药制剂特别是复方制剂含有有效成分多，杂质多，未知成多，含量差异大，作用十分复杂，需要对其中有效成分进行分离研究。而和其他分离方法相比具有柱效高、灵敏度高，快速，重复性好，分辨率高，现已被广泛应用于中药制剂成分分离分析研究。本文综述介绍了 HPLC 发展近况及在中药制剂分析中的应用研究。l1.高效液相色谱技术的类型及发展近况 高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱对样品进行分离测定的色谱方法，其主要类型按固定相的聚集状态包括液液色谱法LLC和 液 固 色 谱 法 LSC 两 大 类 。 按 分 离 机 制 则 包 括 分 配 色 谱 法partitionchromatography、吸附色谱法adsorption ehtomatography、离子交换色谱法ion exchange chromatography；IEC和空间排阻色谱法steric exclusionchromatography；SEC四类基本类型色谱法；最常见的是化学键合相色谱法及由其衍变和发展的离子抑制色谱法ion suppression chromatography；ISC和离子对色谱法paired ion chromatography；PIC或ion pair chromatography；IPC；除此之外，高效液相色谱法还包括许多与分离机制有关的色谱类型，如亲合色谱法affinitychromatophy ； AC 、 手 性 色 谱 法 ehiral chromatography ； CC 、 胶 束 色 谱 法 1micellarchromatography；MC和电色谱法electrochromatography；EC等 。随着色谱技术的发展，结合计算机各种软件的开发，使之HPLC与各种检测仪器联用，更加拓宽了HPLC的应用范围，如HPLCMS联用技术是以高效液相色谱为分离手段，以质谱为鉴定工具的一种分离分析技术，具有高度的专属性，对多数药物的检测灵敏度超过其他分析方法，使定量测试速度显著加快，可以对混合物中的微量组分进行分析，可望成为中药研究中最具有潜力的分离检测手段。目前常用的HPLCMS联用仪具有两大分类系统，一种是从质谱的离子源角度来划分，包括电喷雾离子electrosprayionization，ESI，大气压化学电离atmospheric pressure chemical ionization，APCI和基质辅助激光解吸离子化matrix assisted laserdesorption ionization，MALDI等；另一种是从质谱的质量分析器角度来划分，包括四级杆质谱仪quadrupoleMS，Q-MS，离子阱质谱仪ion MtrapMS，IT-MS，飞行时间质谱仪time of flight 2，3MS，TOFS，傅立叶变换质谱仪fourier transformMS，FTMS 。液相色谱一串联质谱联用技术LCMSMS优点非常显著，液相色谱大大拓宽了分离范围，生物大分子也能分离，而Lc与高选择性、高灵敏度的MSMS结合，可对复杂样品进行实时分析，即使在Lc难分离的情况下，只要通过MS 和MS：对目标化合物进行中性碎片扫描，则可发现并突出混合物中的Et标化合物，显著提高信噪比。这种分离检 4测 技 术 的 发 展 在 很 多 领 域 都 得 到 应 . 超 高 效 液 相 色 谱ultraperformanceliquidchromatography，UPLC是液相色谱领域的新热点之一，它能够提供更加高效和快速的色谱系统。UPLC是指一种采用小颗粒填料色谱柱粒径小于2 wm和超高压系统压力大于10 kPa的新型液相色谱技术，能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时大大缩短分析周期，因此特别适用于微量复杂混合物的分 5离和高通量研究 。l2高效液相色谱法在中药制剂分析中的应用研究2.1 测定中药制剂有效成分含量 用高效液相色谱法测定含量可以消除药物中的杂质，制剂中的附加剂及共存的药物对测定的干扰。中药制剂组成复杂，其中不少有效成分的含量测定也越来越多地采用了高效液相色谱法。中药有效成分的测定已成为评估中药质量的重要标志，实践经验证明，HPLC的适用范围较广，可用于分析高沸点、热不稳定性、大分子量的样品， 6是一种非常有效和普遍适用的中药有效成分的分析方法。赵欣等 测定当归四逆汤中阿魏酸、芍药苷、肉桂酸、甘草酸4种有效成分的含量，阿魏酸的线性为0862064mgL r0999 2，平均回收率为962 ，RSD为15 ；芍药苷的线性为20200 mgL r0999 3，平均回收率为973 ，RSD为10 ；肉桂酸的线性为21273 mgL。r0999 5，平均回收率为94O ，RSD为12 ；甘草酸的线性为2 96 L 1429 mg r0 7， 999 平均回收率为981 ，RSD为2O 。仪器与方法精密度均小于20。该方法能更加全面控制该方的质量，优化后的提取 7歪艺可为今后剂型的改进提供基础。付辉政等 采用HPLC法测定复方柳菊片中的蒙花苷。经方法学考察及阴性对照实验表明方法专属性强，处方中其他成分对蒙花苷的测 8定无干扰，且方法简便、快速、准确、重现性好。周家才等 采用高效液相色谱法测定连蒲双清片中盐酸小檗碱的含量，盐酸小檗碱线性范围为801272 mgLr0999 1，t：5，平均回收率为9974 ，RSD054 n6。该方法准 9确、简便，可用于该制剂的质量控制。原文鹏 等 采用HPLC法测定山丹酮缓释片中丹参酮类成分的含量，丹参酮I、丹参酮A、隐丹参酮和二氢丹参酮的进样量分另0 E0 00 999 0 202 gr0 9、 303 txgr0 9、 202 p 00 999 0 O0 gr09999和020200 txgr 0999 9范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系；丹参酮I、丹参酮A、隐丹参酮和二氢丹参酮的平均回收率分别为9954 、9889 、10010 、9944 ，RSD分别为0 0 1 1 40、 92 、 30 、 53 10n6。本法简单、快速、准确，可用于山丹酮缓释片的质量控制。冯婉姗等 采用HPLC法测定滴通鼻炎水君药麻黄中的盐酸麻黄碱的含量，选C18柱，流动相为甲醇水1：1，流速为10 mlmin，检测波长为254 nm，该方法简便、快速、准确，各批次含量较稳定，适用于本产品的质量控制，可作为该制剂的含量测定方法。2.2 测定中药萍劣行课缓?采用HPLC技术，建立中药有效部位分析的方法，确保中药制剂的质量和临床疗效l 11等的研究和应用日益广泛。冯毅凡等 建立中药复方姜附制剂中干姜有部位的含量测定方法。uV法线性范围1939mgL，相关系数r0999 2，总酚的平均回收率为1014 ，RSD18 n6。HPLC法线性范围0220 Ixg，相关系数r09999，6-姜酚的平均回收率为9857 ，RSD031 n6。本研究中使用的干姜有效部位为干姜药材经超临界CO 萃取所得干姜油，建立姜附制剂中有效部位简单实用的测定方法，该法灵敏，简便，准确和重现性好，对于姜附制剂质量控制具有重要意 12义。胡亚楠 等建立脑脉通有效部位中的阿魏酸的含量测定方法，采用大连依利特HypersilODS2Cl8色谱柱250 mm46 mm，5Ixm，流动相为乙腈01磷酸溶液15：85，流速：10 mlmin，检测波长：316nm。结果：阿魏酸平均回收率为9912 ，RSD为208。所建立的方法简便、准确，精密度、稳定性、重复性良 13好，可作为有效部位的质量控制方法。李伟东 等研究四妙勇安汤抗炎有效部位的有效成分，对四妙勇安汤抗炎有效部位、各单味药以及缺味药的大孔树脂50醇洗液的HPLC图谱进行分析比较。全方有20个峰为共有峰，通过与单昧药、缺味药色谱图的比较，基本确认各峰的归属。结果表明，四妙勇安汤抗炎有效部位含有绿原酸、阿魏酸， 14咖啡酸、甘草苷和肉桂酸等成分，有效部位与金银花的相关性最大。姜华等 建立以高效液相色谱法同时测定资祷仆行课恢需制铡绕蘸托鲁绕蘸康姆椒捎蒙字狧ypersil C， 250 mm46 mm，5 txm，流动相为乙腈-011磷酸水溶液20：80，流速为10 mlmin，柱温为30 ，检测波长为283 nm。柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的进样量分别在044220 Ixgr0999 5、0025 60128 0 gr0999 3、054270 pgr0999 9范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系；三者平均回收率分别为9941 、10033 、9969 ，RSD分别为114 、147 、116。本方法简便，准确、可靠，可用于枳实的质量控制。2.3 在杂质检查中的应用 历年来各国药典中收载了多种药物采用 HPLC 法进行杂质检查的方法，并且可采用 HPLC 法进行杂质检查的药物种类在逐年颁布的药典中有所增加 ，例如在中国药典2005 版 第二部中就增加了 142 个 。随着 HPLC 技术的不断发展有不少国内外药物分析工作者研究和探讨了 HPLC 法在药物的有关物质检查方面的应用，并建立了一些新方法。 HPLC 分离效能高，灵敏，在药物的杂质检查中应用广泛。主要用于药物中有关物质的检查。“有关物质”是指药物中存在的合成原料、中间体、副产物、降解产物等物质，这些物质的结构和性质与药物相似，含量很低，只有采用色谱的方法才能将其分离并检测。若杂质是已知的，又有杂质的对照品，可用杂质对照品做对照进行检查。若杂质是未知的，可以采用主成分自身对照法或峰面积归一化法进行检查.l 15何笑荣等 应用反相高效液相色谱/二极管阵列检测（RP-HPLC-PDAD）技术分析中药降糖制剂中可能存在的西药成分。2.4 在中药复方制剂质量测检方面的应用 中药复方制剂质量控制和质量标准的制定势在必行，但由于中药复方制剂成分的复杂性，给这方面的工作造成很大困难。HPLC 技术在这方面有很大优势，甘草复方 用制剂质量评价常以甘草酸作为指标。 RP-HPLC 以浅性回归法测定甘草酸的结果表明其含量随产地、药材粗细、质地、断面颜色的不同而异，断面越黄，质地硬脆，折断 16性大者甘草酸含量高，为评价甘草复方制剂品质提供了科学依据. 人们由分析中药复方制剂中的一种活性组分到分析几种活性组分，逐渐提高评价中药制剂的水平。日本和台湾的健康福利部门都已明确规定，凡申请检察和注册的中药制剂必须包括至少 17两个做为质量指标的化学成分的含量分析。We 等对 3 种含黄芩 、葛根的中药复方 18制剂 中的黄芩甙 、葛根素进行了测定。Lee 以 0.03磷酸乙腈w 为流动相在cosmosil5C18-AR 柱上用梯度洗脱同时测定了由多味药材构成的中药复方制荆中的甘草甙 、甘草甜素、橙皮甙、桂皮酸、桂皮醛、厚朴酚、和厚朴酚等 7 种活性组分 。 19在同样的柱和流动相条件下 ，lin 等以对羟基苯甲酸丙酯为内标 ，测定了中药制剂中的龙胆苦甙、芒果甙 、小檗碱、黄芩甙、次黄芩素和甘草酸。2.5 在中药复方制剂指纹图谱研究中的应用 由于中药复方制剂成分复杂，现行的各种单一测定法提供的信息量少，无法建立较完善的指纹图谱，因此有人提出建立多维指纹谱尝试解决该问题。其建立既能较系统、完整地解决中药复方制剂质量控制难题，又可为中药研究中缺乏标准品的难题提 20 21供一种新的解决途径 马 。欣 等应用 HPLC-DVD-MS2 法建立了银杏叶提取物的多维指纹图谱，同时建立了质谱总离子流TIC 指纹图谱，检测了银杏叶中四种有效成分 黄酮和内酯类化合物 。样品经 前处理后 ，应用 Agilent HPLC 色谱条件和API-ES-MS 条件分析了法国、香港、山东等 10 个厂家样品。结果提取物的 HPLC 有33 个峰 MS 总离子流有 51 个峰。并以芦丁为参照物，计算了样品的相似度。戴德舜22，23 等在研究桂枝汤指纹图谱时采用 HPLC-MS-MS 等法对其中具有双向调节作用的 A 5部分、 种单味药 A 部分及各单味药按收率和组方用量配比制得的 A 部分进行指纹图谱测定，并将其阐述为多维全息化学特征谱，对桂枝汤 A 部分产生双向调节作用的物质基础作了初步讨论，说明多维化学特征谱提供的大量信息可较好地反映复方及单味药物信息，所显示的各项参数如能配合一定指标的成分信息，将成为复方质量控l制的有效指标，并可在一定程度上作为药效特征的有力佐证。多维指纹图谱专属性强，因为对中药中某成分有保留时间、UV 图谱、相对分子量和特征碎片 4 种信息，为中药研究中缺乏对照品提高了可能性。2.6 在中药配伍中的应用 中药汤剂多为复方，每种生药又含有多种化学成分。临床共煎过程中可能产生挥发、分解、助溶、吸附、水解、取代、中和、沉淀等一系列十分复杂的化学物理变化，这些变化直接影响到制剂的疗效和毒副作用。用反相高效液相色谱法测定川芎单煎剂，川芎、丹参合煎剂，川芎、当归合煎剂及改味四物汤中阿魏酸的含量时发现各组 24汤剂中阿魏酸的含量差异有统计学意义，配伍熟地对阿魏酸的溶出具有助溶作用。 25吴昭晖等 利用 HPLC 法研究配伍对麻黄汤中苦杏仁苷含量的影响。采用 L82 7正交设计和统计方法 统计软件 SPSS 10 .0 0 以 HPLC 法测定苦杏仁苷的含量。结果该法简便、准确、灵敏 复方中其他成分对测定无干扰 可用于麻黄汤中苦杏仁苷的含量测定 麻黄、桂枝、甘草对方中苦杏仁苷含量的影响差异不存在显著性 两两交互作用差异不具有显著性。得出结论麻黄、桂枝、甘草对麻黄汤中苦杏仁苷含 26量影响没有显著性。杜秀芳等 利用高效液相色谱法考察丹红注射液与 10氯化钾注射液配伍的稳定性。方法采用高效液相色谱法（HPLC）梯度洗脱测定配伍液中 6 h内丹参素、原儿茶醛、丹酚酸 B 的含量。并在 25时 24 h 测定配伍液的 pH 值。结果丹红注射液与 10氯化钾配伍后 24 h 内 pH 值无显著变化，丹红注射液中有效成分丹参素、原儿茶醛和丹酚酸 B 的含量 6 h 内基本稳定。结论配伍液中丹参素、原儿茶醛、丹酚酸 B 的质量和 pH 值基本稳定。2.7 在中药复方的药动学研究中的应用 中药复方药物能体现中药配伍的整体性，发挥综合性伍用作用，是中医方剂学的传统，因此，探讨中药复方药物的药动学规律已成为研究的热点。王晓强等27研究黄连与生地黄不同比例配伍对小檗碱在大鼠体内药动学的影响，给各组大鼠分别灌胃给予黄连 ：生地黄为 1