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第二章 基因工程中常用的工具酶限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶用于DNA和RNA的连接核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类-用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。2-1 核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。 核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）一 、限制修饰系统的种类（图）二、 限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制酶。2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：Hind前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“”表示菌系为型血清型；“”表示分离到的第三个限制酶。EcoRIEscherichia coli RI HindHaemophilus influensae d SacI (II)Streptomyces achromagenes I ()三、型和型核酸内切限制酶的缺点 a.型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp的地方可以随机地切割DNA分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。远距离随机切割b. 型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分子。远距离定点切割c.型核酸内切限制酶和型核酸内切限制酶，在切割反应过程中，都会沿着DNA分子移动，因此是一种需要能量的过程。需要能量的反应d.型和型核酸内切限制酶，一般都是大型的多亚基的复合物，既具有内切酶活性，又具有甲基化酶活性。内切酶活性和甲基化酶活性四、型核酸内切限制酶的特点 (1)基本特点： 在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列，即所谓的识别序列，并由此切割DNA分子形成链的断裂；识别序列 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；单链切割部位 因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端 此类型核酸内切限制酶比较简单，不需要能量分子ATP，但需加入Mg+离子，而且是从其识别序列内部切割DNA分子 在结构上是一种单一的成分，即与型型酶不同，不具有多种亚基成分；(2)识别位点又称切割位点、识别序列或靶子序列。绝大多数型核酸内切限制酶都能够识别由4、5、6或7个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。例如EcoRI识别的序列是GAATTC，我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。呈典型的旋转对称型回文结构(3)平末端与粘性末端由核酸内切限制酶的作用而造成的DNA分子的断裂作用，通常有下列两种不同的方式：两条链上的断裂位置是处于一个对称结构的中心，结果形成具平末端的DNA片段。Blunt ends两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对轴排列，结果形成具粘性末端的DNA片段。Cohesive ends粘性末端概念(定义)：（图）*是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链末端的结构，它们能够通过互补碱基间的相互作用而重新环化起来。(4)限制酶的识别序列与切割频率具4个核苷酸组成的识别序列的限制酶如Sau3A的切割频率为44=256具由6个核苷酸组成的识别序列的限制酶如BanHI的切割频率为46=4096以上假定条件是，在一条随机排列的DNA序列中，假定所有的4种核苷酸都有同等出现的频率，那么任何一种4核苷酸或6核苷酸的识别靶子都有上述的出现频率。(5)同裂酶(isoschizomers)识别同样核苷酸序列的一些来源不同的核酸内切限制酶称为同裂酶。例如HpaI和MspI就是一对同裂酶。同裂酶形成同样的末端。有些同裂酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，可用来研究DNA甲基化作用。(6)同尾酶(isocaudamers)一些来源不同、识别的靶子序列也各不相同，但却能产生出相同的粘性末端，特称为同尾酶。例如BamHI、Bgl、Sau3A等即是一组同尾酶。BamHI GGATCCBgl AGATCTSau3A GATC*同尾酶在基因克隆中有用处，举例说明：但产生的重组体中原识别位点发生了变化。(7)识别多核苷酸序列的酶 例如Hind就是能够识别多种核苷酸序列的一种核酸内切限制酶：5-CTPyPuAC-3 其Py=嘧啶碱基C或T；Pu=表示嘌呤碱基A或G五、影响核酸内切酶活性的因素(1)DNA的分子特性a.限制酶识别位点周围的碱基成分b.特定DNA分子中所具有的目标限制酶识别位点的密度。c.完全消化超盘旋的DNA要比完全消化等量的线性DNA需消耗更多的限制酶。d.DNA的甲基化程度完全切割不同来源的DNA样品所需的限制酶单位（图）(2)酶切消化反应温度a.最适酶切消化温度不同的核酸内切限制酶的最适的消化温度是不同的。酶切温度高于或低于最适温度，都会影响限制酶活性，甚至失活。b.限制酶的星号活力限制酶的星号活力是指在酶反应条件发生改变(变更)的情况下，该酶便失去了识别其固有的特异序列(识别位点)的能力，而会在新的识别位点上发生DNA分子的切割作用(即识别序列发生了改变)。 (3)DNA纯度酶切反应体系中的一些试剂成分，会改变限制酶的切割特性。因此DNA制剂的纯度对酶的活性会有很大的影响 六、核酸内切限制酶对DNA的消化作用应用X射线晶体学技术，测定限制酶DNA复合物的分子结构的研究，指出型核酸内切酶，是以同型二聚体形式与靶DNA序列发生作用，以EcoR 为例，它是以同型二聚体上的6个氨基酸（每个亚基各有一个Glu和2个Arg残基），同识别序列上的嘌呤残基形成12个氢键的形式，而结合到靶DNA识别序列并从此发生链的切割反应。2.2 DNA连接酶定义：能催化两个DNA片段末端之间-P和-OH基团形成磷酸二酯键，使两个末端连接的酶称为DNA连接酶（DNA ligase）。目前已经知道有四种方法可以在体外将DNA片段连接起来：a.用DNA连接酶将具有互补粘性末端的片段连接起来b.用T4 DNA连接酶将平末端的DNA片段连接起来c.先在DNA片段两端加上poly(dA)-poly(dT)尾巴，然后用DNA连接酶将之连接起来。d.先在DNA片段两端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端，然后再用DNA连接酶将之连接起来。一、连接条件：a.DNA连接酶要求在一条DNA链的3-末端具有一个游离的羟基(-OH)和另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基团(P)，才能发挥其连接作用；b.由于在-OH和-P基团之间形成磷酸二酯键是一种需能的过程(反应)，因此需要能源分子的存在才能实现连接反应。在大肠杆菌细胞中连接酶催化的连接能源是：NAD+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)在动物细胞和噬菌体中，连接酶催化的连接能源是：ATP腺苷三磷酸二、最佳连接温度理论上连接酶体外最佳连接温度是37，但在此温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的。因此实际上的最佳连接温度应是界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般经验认为是415比较合适。三、DNA连接酶的反应条件（图）四、末端DNA片段的连接过程 （图）2.3 DNA 聚合酶常用聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶 、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、修饰的T7DNA聚合酶、反转录酶等。共同特点：都能够把将脱氧核糖核苷酸连续地加到引物链的3-OH末端，催化核苷酸聚合，而不发生从引物模板上解离的情况。但大多数聚合能力差，参入不到10个核苷酸，就从引物模版解离下来：大肠杆菌DNA聚合酶、 Klenow酶、 T4 DNA聚合酶。参入数百个核苷酸： T7 DNA聚合酶一、大肠杆菌DNA聚合酶1.大肠杆菌DNA聚合酶 性质： 53聚合酶活性； 53外切酶活性； 3 5外切酶活性聚合作用发生在引物链3-OH末端同参入的核苷酸之间，当这个外源核苷酸参入之后，又提供一个新的3OH，因此，聚合酶催化的链的合成是按53方向生长当反应物中缺乏dNTPs，表现出3 5外切酶活性，将从游离的3-OH末端逐渐的降解单链及双链DNA。2.DNA缺口转移与探针的制备在分子克隆中的主要用途：通过缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。原理： 53外切酶活性从缺口的5一侧移去一个5核苷酸，聚合作用就在3一侧补上一个新的核苷酸。但是聚合酶不能够在3-OH和5-P之间形成键，因此随着反应的进行， 5-侧核苷酸被不断的移去， 3一侧核苷酸又按序的补加，于是缺口沿着DNA分子合成的方向移动。缺口转移探针制备（图）反应体系：特定的DNA；DNase；Pol；32PdNTPs二、Klenow酶来源：大肠杆菌DNA聚合酶全酶，经枯草杆菌蛋白酶处理之后，产生出来分子量为76103dal的大分子功能： 5-3聚合酶活性； 3-5外切酶活性用途：修补经限制酶消化形成的3隐蔽末端 标记DNA片段的末端 cDNA克隆中的第二链cDNA的合成 DNA序列测定缺点：不能够有效的标记带有3突出的DNA末端。同位素标记DNA片段的末端（图）三、 T4 DNA聚合酶来源：T4噬菌体感染的大肠肝菌培养物中纯化出来的一种特殊的DNA聚合酶。它是由噬菌体基因43编码T4 DNA聚合酶基本特征（图）3-5外切酶活性（图）取代合成法标记DNA片段（图）在没有dNTPs的情况下，3外切酶活性便是T4 DNA聚合酶的独特功能，它作用于双链DNA，并按3 5的方向从3OH末端开始降解DNA。如果反应物中只有一种dNTPs，那么这种降解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸时就会停止，从而产生出具有一定长度的3隐蔽末端DNA片段。当反应物中加入标记的32P-dNTPs，这种局部消化的DNA片段便起到一种引物模板的作用， T4 DNA聚合酶的聚合作用超过了外切作用，反应物中32P-dNTPs逐渐取代了被外切活性删除掉的DNA片段上的原有核苷酸取代合成。取代合成法制备探针的优点：不会出现人为的发夹结构（用缺口转移法制备的探针则会出现这种结构）应用适宜的核酸内切限制酶切割，他们便可以很容易地转变成特定序列的探针。四、依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）目前已经从许多种RNA肿瘤病毒中分离到这种酶，但最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒的反转录酶。它是由和两条多肽链组成的：多肽链具有转录酶活性5-3（聚合活性）和RNaseH活性。RNaseH活性是由多肽链经蛋白酶水解切割后产生的一种多肽片段，它以5-3或 3-5的方向特异的降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链；多肽链具有以RNA-DNA杂交分子为底物的5-3脱氧核酸外切酶活性它的53方向的聚合活性，取决于有一段引物和一条模板分子的存在，它可以用mRNA为模板。以用mRNA为模板合成cDNA，是反转录酶的最主要用途。也可以用单链DNA或RNA作模板合成供实验用的分子探针。图1：以RNA为模板聚合互补DNA图2：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链五、 T7 DNA聚合酶它是从感染了T7噬菌体的大肠肝菌寄主细胞中纯化出来的一种核酸酶。T7DNA聚合酶是按两种亚基形式纯化出来的:其中基因5蛋白质本身是一种非加工的DNA聚合酶，具有单链的3-5核酸外切酶活性。其二，硫氧还蛋白，作为一种辅助蛋白，增加基因5蛋白质同引物模板的亲和性，使DNA的加工合成达数千个核苷酸。此外，T7DNA聚合酶还具有很高的单链及双链的3-5核酸外切酶活性。T7 DNA聚合酶的用途大分子量模板上引物开始的DNA延伸合成。合成中，不受DNA二级结构的影响。同T4 DNA聚合酶一样，T7DNA聚合酶通过单纯的延伸或取代合成标记DNA的3-末端。T7DNA聚合酶和T4DNA聚合酶一样，将双链DNA的3和5突出末端，转变成平末端的结构。2.4 核酸酶一、核酸外切酶：一类从多核苷酸链的一头开始按序催化降解核苷酸的酶。分为单链核酸外切酶和双链核酸外切酶单链核酸外切酶： 大肠杆菌核酸外切酶（exo） 大肠杆菌核酸外切酶（exo）双链核酸外切酶： 大肠杆菌核酸外切酶（exo ） 噬菌体核酸外切酶（ exo ）大肠杆菌核酸外切酶（exo）它能够从5-末端或3-末端降解DNA分子，产生出寡核苷酸短片段。是一种不需要Mg2+离子的核酸酶 （图）大肠杆菌核酸外切酶（exo核酸外切酶的主要活性是，按35的方向催化双链DNA自3-OH末端释放5-单核苷酸 （图）噬菌体核酸外切酶（ exo ）（图）核酸外切酶最初是从感染了噬菌体的大肠杆菌细胞中纯化出来的。这种酶催化双链DNA分子自5-P末端进行逐步的加工和水解，释放出5单核苷酸，但它不能降解5-OH末端核酸外切酶的用途有两个方面：第一，将双链DNA转变成单链的DNA，供按双脱氧法进行DNA序列分析使用；第二，从双链DNA中移去5突出末端，以便用末端转移酶进行加尾。二、核酸内切酶1. S1核酸酶来自从稻谷曲霉，是一种高度单链特异的核酸内切酶，它降解单链DNA的速率要比双链DNA快75000倍，酶活性的表现需要Zn2，最适PH为4.0-4.3。（1）主要功能： 催化RNA和单链DNA分子降解成5单核苷酸， 作用于双链DNA分子的单链区，而且这种单链区可以小到只有一个碱基对。图1：内切单链DNA或RNA图2：内切带切口的或缺口的双链DNA或RNA（2）主要用途：测定杂种核酸分子（DNA-DNA或RNA-DNA）的杂交程度。给RNA分子定位。测定真核基因中间隔子序列的位置，探测双螺旋的DNA区域。从限制酶产生的黏性末端中移去单链突出序列。打开在双链cDNA合成期间形成的发夹结构等实验操作。RNA分子定位（图）一个RNA分子是由其模板DNA中的4001400之间的核苷酸序列编码的。这条RNA分子同包含核苷酸4001400的DNA编码链杂交，然后再用S1核酸酶处理，那么RNADNA杂种分子中的单链尾巴会被降解掉，形成一条长度为1000bp的平末端的RNADNA杂种分子，回收这种分子，便可以测定出这段抗S1核酸酶的DNA片段长度。如果所用的这段DNA是放射性标记的，其长度可用凝胶放射自显影测定。2. Bal31核酸酶来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana）具有单链特异的核酸内切酶活性和双链特异的核酸外切酶活性。当底物是双链环形DNA，Bal31的单链特异的核酸内切酶活性，通过对单链缺口或瞬时单链区的降解，将超盘旋的DNA切割成开环DNA，进而成为线性双链DNA当底物是线性双链DNA分子时Bal31双链特异的核酸外切酶活性，会从5和3两末端移去核苷酸。（图）Bal31核酸酶的活性需要Ca2和Mg2+。它是分子克隆中十分有价值的工具酶，其主要用途有：诱发DNA发生缺失突变；定位测定DNA片段中限制位点的分布；研究超盘旋DNA分子的二级结构，并改变因诱变剂处理所出现的双链DNA的螺旋结构。诱发DNA发生缺失突变（图）定位测定DNA片段中限制位点的分布先用Bal31核酸酶处理待测的线性DNA片段，使之以渐进的速度从5和3两末端同时降解DNA，并在不同的时间间隔加入EGTA，终止Bal31核酸酶的消化作用，然后用苯酚抽提样品，再加入我们期望使用的核酸内切限制酶进行在消化。如此按不同时间取样的DNA消化样品，同只用核酸内切限制酶消化的对照组DNA样品，一道进行凝胶电泳分析。DNA片段从凝胶中消失的先后次序，代表这些片段在DNA分子中的前后排列位置。根据这些结果，便可以把这些DNA片段按正确的顺序排列出来，并确定出有关限制酶的识别位点。2.5 核酸修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）末端脱氧核苷酸转移酶能够催化5-脱氧核苷三磷酸进行5向3方向的聚合作用，逐个的将脱氧核苷酸分子加到线性分子的3-OH末端，但是它不需要模板，4种dNTPs都可以作为它的前体。接受核苷酸聚合的受体DNA，可以是具有3-OH末端的单链DNA，也可以是具有3-OH末端的双链DNA平末端不是末端脱氧核苷酸转移酶的有效底物，但如果用Co2+取代Mg2+离子作为辅助因子，便可以成为它的有效底物。（图）末端脱氧核苷酸转移酶的主要用途分别给外源DN