血片制作染色与疟原虫计数-宣恩疾病预防控制中心ppt课件

疟疾血片的制作、染色、镜检,宣恩县疾病预防控制中心2012年4月,检出疟疾的病原体-疟原虫,是明确诊断的最直接证据.目前常用厚薄血膜法,因其具有操作简便敏感价廉和可鉴别虫种等优点,广泛用于疟疾的病原学诊断已近一个世纪,显微镜检查是疟疾诊断的金标准,且也是目前最常用的方法之一.,血膜的制作,用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘，称厚血膜。薄血膜上的血细胞要求平辅在玻片上面。,标本片,血膜的制作（取血时间）,取血时机疑似疟疾时,应在病人发热时采血.疟疾普查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。间日疟在寒热发作时，外周血液中主要可见环状体期；发作后68小时，环状体发育到滋养体期，疟色素形成，形态较易辩认，为诊断的有利时机；3648小时，可检出裂殖体；发作一、二次后，配子体出现较多。恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20小时内取血，初发患者退热后常查不到原虫。患者刚开始发作时原虫密度很低,血检时可能查不到疟原虫,应在第二次发作时再次血检以免漏诊.,血膜的制作（取血操作）,取血方法采血部位一般人为耳垂，指头，通常在耳垂取血（现场取血建议用大头针采血，一人一针，避免血传疾病）。先用75%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手捻动耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方，右手持消毒针迅速刺入耳垂下端12毫米，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向挤压出血。如采用静脉血，用针头滴一点血在玻片上。,取血量及涂片法（涂片操作）,薄血膜取洁净的载玻片2张，1张平置在桌上，以左手拇指，食指夹持载玻片两端（手指切勿接触玻片表面），用另一张边缘平滑（最好为磨口边缘）的载玻片做推片，用推片一端边缘的中点从取血部分取约1微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，并形成2530度夹角，待血液向两侧扩展约2厘米长度时，从右向左迅速向前推成舌状血膜.推片时，用力不均，则易成波浪起伏状；用力太大，则血膜两端过厚，中间过薄；若玻片上有油腻，则所涂的血膜很不均匀而成多孔状。,（涂片操作）,厚血膜用推片的一角，从取血部位刮取约4.5微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转24圈，涂成直径0.81厘米大小圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。,血膜的制作（涂片操作）,涂制厚、薄血膜的位置通常是将厚、薄血膜涂在一张载片上。方法是将载片分为6等分，第1、2格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各1个.,标签,血膜的编号,血膜编号血膜制成后，立即用特种蜡笔（或油性记号笔）在玻片标签上写上受检者的编号，以防差错。注意：血片编号要与血检登记簿上编号一致！编号由5位数字组成，前2位为所在地前二字的声母简写，后三位为阿拉伯数字。如李家河1号血片编为为LJ001，沙道为SD001,制作血膜的注意事项,1.新购玻片清洗须清洗干净，或者用95%乙醇浸泡5-10分钟，擦干备用。制作血膜的载玻片必须完全清洁而毫无油渍或污垢。制片时，手指只能持载片的边缘，不能接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。,制作血膜的注意事项,2.刚涂制的血膜要平放在标本盒内，厚血膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不一溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜，干后应及时装入标本盒并盖严，新的木制标本盒需敞开放置一段时间，让木醇挥发后才能使用，以免厚血膜红蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。,制作血膜的注意事项,3.血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤（可致血红蛋白凝固而无法脱落），干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能2448小时内固定染色；冬天也不能超过72小时。放置时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差。若不能及时染色，膜血膜宜先用甲醇固定（13分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干固定后装入盒内盖严，待以后染色。,血片的染色（一）染液的种类及染色原理,染液种类：目前所用的血片染色液有瑞氏和吉氏染液及瑞吉氏复合液等。这些染液中的主要染剂都包含美兰、伊红和由美兰氧化所成的天青。,血片的染色（一）染液的种类及染色原理,染色原理：疟原虫染色原理是染料与被染物的阴阳离子想到吸附而结合的一种化学反应。各种细胞和疟原虫主要是由不同的蛋白质或类氨基酸组成。主要染料都含有美蓝、红和美蓝氧化后的天青。伊红是酸性水溶性钠盐，美兰是碱性水溶性盐酸盐，当它们各自溶化水中时，就离解为带阳电和阴电的离子。伊红主要离解为酸性的阳离子，在遇到碱性的蛋白质如血红蛋白、嗜伊红白血球颗粒等即可结合成不易溶于水的沉淀物染成红色。美兰主要离解为碱性的美兰离子，美兰就与疟原虫、淋巴和大单核细胞的胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质结合染成兰色。,血片的染色（二）吉氏染液血片染色方法,1.薄血膜固定血膜完全干燥后，薄血膜要用甲醇或无水乙醇固定(用吸有甲醇的吸管在薄血膜表面轻轻涂抹，自然干燥）。注意固定时甲醇不要接触厚血膜。若固定后不能立即染色，应待甲醇挥发后再装入专用玻片盒中。2.厚血膜溶血染色前用蒸馏水或清水溶血,新鲜血膜可不溶血直接染色.如不能及时染色，宜在48小时内进行溶血处理再保存。3.染色染液的稀释和染色冲洗用水常用的是中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水,为了使血膜着色较好,应用PH7.2水效果最佳.单片染色单张血膜染色可取蒸馏水或缓冲液1ml加入吉氏染液原液1滴,混合均匀后,滴在厚薄血膜上,染色2030分钟,然后水洗,晾干.,血片的染色（二）吉氏染液血片染色方法,多片染色:将血膜朝一个方面插入染色缸中,或每对玻片血膜朝外,背靠背插入染色缸中,倒入新配的2%吉氏染液(2ml吉氏染液原液与98ml蒸馏水缓冲液混匀),浸没厚薄血膜,染色30分钟,向染色缸中注入缓冲液或自来水,直到溢出,除掉染液表面上的浮渣,将染色缸中残余的染液倾出,加入新水,反复冲23次,然后取出玻片,将血膜朝下插在晾片上干燥.,影响染色效果的因素,血片染色好坏除了与玻片是否清洁，血片制作质量好坏等有关外，还受到以下几个因素的影响：（1）染料溶剂的质量染料、甲醇和甘油如果不纯，常使配制的染液偏酸或偏碱而影响染色效果。因此必须用分析纯的甲醇和中性甘油，而且在配制时所用的器具必须干净而无水份。,影响染色效果的因素,（2）染液的新旧新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力较弱且常呈现偏碱性。染液存放时间越久，染色力越强。通常在染液配制12周后才使用，盛装染液的瓶子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。,影响染色效果的因素,（3）染液稀释后使用时间吉氏和瑞氏染液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生沉淀。因此，必须在稀释染液当时使用，一般在半小时内染色力最强。,影响染色效果的因素,（4）染液的稀释浓度染液的浓度高其着色就快而深，从而疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度过低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不明显或消失。,影响染色效果的因素,（5）染色时间染色时间长染色效果好，反之较差。室温高则着色快，染色时间可略缩短，气温低可适当延长。因此染色时间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和气温而适当增减。,影响染色效果的因素,（6）染色用水染液的稀释用水和染色后冲洗用水应选择Ph7.07.2清洁水，通常使用的新鲜的蒸馏水或过滤的冷开水，以及自来水、井水、河水、泉水和雨水等。如果偏酸或偏碱，可用缓冲蒸馏水调整。染色后发现血膜颜色偏蓝（偏碱）或偏红（偏酸）时，可用与之相反的酸、碱度水冲洗血片予以纠正。,影响染色效果的因素,（7）染色后不要直接将染液倒掉，应沿玻片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。染色效果较好的血膜,血膜外观呈兰紫色。镜下红细胞呈淡红色,嗜酸性粒细胞呈鲜红色,嗜中性粒细胞核呈紫蓝色,淋巴细胞及疟原虫胞浆呈蓝色或淡蓝色,疟原虫核呈红色.,.,血片镜检,1.血膜上滴加镜油,滴一滴液体石蜡在血膜上,再将血片置载物台上.2.镜检用目镜5*和物镜1040*低倍镜检下找到血膜,再将物镜转换成油镜(100*),查找疟原虫.3.观察血膜方法镜检时从血膜的一端开始,自上而下,自左而右,逐个视野顺序查看,发热病人血片至少要查完200个视野以上方可报告结果.镜检疟原虫一般只查厚血膜,薄血膜作为疟原虫的分类定种.4.结果判定:结果报告分为阳性和阴性,阳性者至少要查见一个典型疟原虫(并需鉴定虫种和期别)方可确定,以查完整个厚血膜,未查见疟原虫判为阴性.,.,显微镜的使用与保养,.,显微镜结构及模拟图,.,显微镜的使用,使用前阅读说明、掌握结构、检查部件。光源及工作条件显微镜无自带光源时，可用自然光或灯光，使用有色灯光（如白炽灯炮）则需加滤光片。工作台最好靠向北窗口，显微镜不能被太阳光照射，用防尘罩或布罩好，工作台和工作凳高低要恰当。,.,姿势要端正、养成两眼都观察的习惯。对光低倍镜：自然光或灯光一般用平面反光镜对光。高倍镜和油镜：一般用凹面反光镜对光。调焦将标本固定在载物台之推进器内，先用低倍物镜、目镜组成光路调节焦点，调焦时最好先用眼睛观察物镜接近标本到较小距离，然后再观察镜内调节物镜离开标本，直至镜内物象清晰为止。,.,转换物镜当物镜的旋转盘轻轻转动时，听到“卡”声（手指也有搏动感）时即换好了镜头（镜头到位），只需略调纽调节螺旋则物象清晰。镜检标本镜检标本时移动的方向应有次序，比如呈“弓”形，不要盲乱移动，以免浪费时间和漏检。,.,使用油镜头使用油镜头时将标本上滴加12滴镜油（中性液体石腊），再仔细调焦。观察完毕应立即用专门的试镜纸擦净镜油，如有不易擦净的油垢，可用无水乙醇拭擦后再用干镜纸擦一次。显微镜防护镜检完毕，应做好显微镜的清洁，将物镜旋成“八”字形附在载物台上，用防尘罩罩好。,.,1、防尘：显微镜工作室应清洁、无灰尘进入，显微镜应配置防尘罩，不拆卸镜头，防止灰尘浸入。2、防潮（霉）：显微镜应置于