聚合酶链式反应的应用指南精讲PPT课件

1,.,聚合酶链式反应的应用指南,.,2,PCR历史演变PCR技术简介PCR的临床应用,.,3,1984年，Kary.B.Mullis教授发明了具有划时代意义的PCR技术。并因此项技术于1993年获得诺贝尔化学奖。1985年，实验室技术成熟并逐步在临床上应用。二十世纪九十年代开始，在国内各级医院广泛开展。2000年左右，全国开始规范化管理，工作人员需要培训资质，实验室需经过相关机构认证。,PCR历史演变,.,4,PCR技术简介,所谓PCR技术，指的是在体外，以某一保守区段为模板，以一对特异性引物进行诱导，以游离的碱基为原料，在Taq酶的催化下，对目的基因迅速扩增的一种分子生物学技术。,一、PCR的概念,1、体外扩增2、迅速大量扩增3、灵敏度高4、特异性高,二、技术特点,变性：使双链DNA变为单链。退火：使引物和互补模板结合。延伸：按53方向以引物为起始点复制,循环次数DNA的链数121222243238102101024202201,048,576302301,073,741,82410亿,.,6,三、PCR技术分类,1、普通PCR检测技术2、实时荧光定量PCR检测技术3、高敏感度内标荧光定量PCR检测技术,.,7,PCR的临床应用,用于苛养病原菌的鉴定用于培养周期较长的病原菌检测用于目前难以或者不能培养病原菌检测病原菌载量分析病毒类疾病诊断需要快速汇报结果的病原菌检测细菌或肿瘤细胞耐药基因检测遗传代谢病的分子诊断,.,8,（一）、检测适宜人群,1、疑似肝炎患者。2、需要进行抗病毒治疗效果评估患者。3、需调整抗肝炎病毒治疗方案者。4、有肝炎病史且已治愈的拟受孕及孕期女性。5、有肝炎病史且已治愈的拟母乳喂养及哺乳期妇女。6、有肝炎病史且已治愈的拟生育男性。7、肝炎所致肝癌后做过肝移植手术以后患者。8、血液制品及献血员筛查。9、转氨酶正常、血清学指标改变后，需要停止药物治疗的患者。,一、乙型肝炎/丙型肝炎检测,.,9,（二）、如何检测,1、疑似病人随时抽血进行检测。2、乙型肝炎患者抗病毒治疗期间，至少每3个月监测一次HBV-DNA水平。3、对于抗HCV阳性者、考虑接受抗病毒治疗者，在开始治疗前、治疗第4周、第12周，均需要进行HCV-RNA检测。4、有肝炎病史且已治愈的拟生育男、女性，应在受孕前进行病毒载量检测。5、有肝炎病史且已治愈的孕期妇女，应在受孕早期、中期及晚期均进行病毒载量检测。6、有肝炎病史且已治愈的生育后妇女，若想母乳喂养婴儿，应在哺乳期间，定期进行病毒载量检测。7、献血员及肝移植术后患者应定期进行病毒载量检测。,.,10,（三）、标本采集,采集EDTA抗凝（紫帽血常规管）静脉血2-3ml。患者抽血前需要空腹。,注意：标本要及时送到实验室，尤其是丙型肝炎病毒，应于采血后尽快送检。,.,11,二、HPV（人类乳头瘤病毒）检测,HPV病毒感染与子宫颈糜烂、尖锐湿疣和宫颈癌等妇科疾病高度相关，其中高危型HPV持续感染时导致宫颈癌的主要原因，而且从感染HPV到发展成为宫颈癌大约需要10年时间。HPV感染所致宫颈癌是唯一一种病因明确，可以早期预防与治疗及彻底根治的肿瘤。一项调查表明，我国约18%的女性高危型HPV检测阳性，但是25岁以上，有超过80%的人从未做过宫颈癌预防筛查。,.,12,（一）检测适宜人群,1、有性生活史的女性2、有不洁性交史的男性或女性3、疑似尖锐湿疣患者诊断4、25岁以上女性健康普查,.,13,（二）、如何检测,疑似宫颈癌患者检测通常采用细胞形态学检测（TCT）和病原学检测两种方法。但由于HPV感染早期，细胞形态学改变不显著，单纯依靠TCT结果会造成漏检。采取PCR与反向杂交技术进行检测，是明确诊断的关键手段。,.,14,（三）、标本采集,1、使用窥器暴露宫颈，使用专用的HPV采样刷置于宫颈口，逆时针方向转三圈，并停留十秒。把采样刷放入专用的标本储存瓶里，折断采样刷多余的部份，切勿将采样刷丢掉，以保留足量标本。盖好盖子，标记好送检验室检测。2、若为尖锐湿疣患者，可以采集疣体组织进行送检。3、男性患者可以采集尿道拭子送检。,注意：采集HPV标本前三天不要阴道用药或冲洗；避免经期采样，少量血液不影响检测结果；采样前不要进行醋酸或碘液涂抹。,.,15,三、性病三项（NG、CT、UU）检测,淋病奈瑟菌（NG）、沙眼衣原体（CT）、解脲支原体（UU）是引起淋病性尿道炎/阴道炎、非淋病性尿道炎/阴道炎的病原体。常规检测采用细菌培养技术，由于NG抵抗力差，易死亡；CT目前上不能够体外培养；UU培养较为困难，故传统微生物法检测存在困难。,.,16,（一）检测适宜人群,1、疑似性病患者诊断2、有不洁性交史者筛查3、夫妻双方一方患有性病，另一方筛查,.,17,1、男性：清洁尿道后，采用专用拭子插入尿道2cm处，旋转后取出，放置在无菌管中送检。2、女性：清洁外阴后，采用专用拭子在子宫颈口处采集标本（停留数秒），转入无菌管中送检。3、尿道炎患者若无明显分泌物，可以采集前段晨尿作为标本送检。,（二）标本采集,.,18,四、其他病原体检测,EB检测：依据病原体寄生及复制释放部位，建议采用