药物的杂质检查(第二军医大学)PPT课件

.,1,第一节概述,一、药物纯度及其要求二、杂质的来源与种类三、杂质的限量,.,2,第二节一般杂质的检查方法氯化物检查（ChP2010二部附录A）原理:利用药物中的微量氯化物在硝酸酸性条件下与硝酸银反应，生成氯化银交替微粒而显白色浑浊，与一定量的标准氯化钠溶液在相同条件下产生的氯化银浑浊程度比较，判断供试品中氯化物是否符合限量规定。,.,3,取各药品项下规定量的供试品，加水溶解使成25ml，再加稀硝酸10ml；置50ml纳氏比色管中，加水使成约40ml，摇匀，即得供试溶液。另取各药品项下规定量的标准氯化钠溶液，置50ml纳氏比色管中，加稀硝酸10ml，加水使成40ml，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入硝酸银试液1.0ml，用水稀释至50ml，摇匀，在暗处放置5分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察，比较，即得。,操作方法,.,4,氯化物取本品0.60g，依法检查（附录A），与标准氯化钠溶液6.0ml制成的对照液比较，不得更浓（0.01%）。,中国药典葡萄糖中氯化物的检查,.,5,特别注意：带色供试品中氯化物检查内消色法取供试品溶液两份，于其中一份中先加入硝酸银试液，如显浑浊，可反复滤过（滤纸事先用含有硝酸的水洗净其上的氯化物），至滤液澄清，即得无氯化物杂质又具有相同颜色的澄清溶液，再加入规定量的标准氯化钠溶液与水适量，作为对照溶液；另一份中加入硝酸银试液1.0ml与水适量使成50ml，作为供试溶液，再依法检查。,.,6,不同溶解性质的供试品溶于水的有机药物，可直接依法检查；不溶于水的有机药物，多数采用加水振摇，使所含氯化物溶解，滤除不溶物或加热溶解供试品，放冷后析出沉淀，滤过，取滤液依法检查；溶于稀乙醇或丙酮中的有机药物，可加稀乙醇或丙酮溶解后依法检查。,.,7,硫酸盐检查法（ChP2010二部附录B）硫酸钡白色浑浊纳氏比色管比浊铁盐检查法（ChP2010二部附录G）红色可溶性硫氰酸铁配离子纳氏比色管比色,第二节一般杂质的检查方法,.,8,重金属检查法LimitTestforHeavyMetalsChP2010二部附录H,第二节一般杂质的检查方法,.,9,1.重金属元素的危害定义：在实验条件下能与S2-作用显色的金属杂质，如银、铅、汞、铜、镉、铋、锑、锡等。与体内酶蛋白上的SH和S=S键牢固结合,从而使蛋白质变性失活。铅:损害神经系统，造血系统，血管和消化系统；汞:损害肾脏，造成肾功能衰竭。重金属以铅为代表。,.,10,2.硫代乙酰胺法（第一法）1）原理硫代乙酰胺在弱酸性（pH3.5醋酸盐缓冲液）条件下水解，产生硫化氢，与微量重金属离子生成黄色到棕黑色的硫化物均匀混悬液。CH3CSNH2+H2OCH3CONH2+H2SH2S+Pb2+PbS+2H+,.,11,2）操作方法取各药品项下规定量的供试品，加醋酸盐缓冲液(pH3.5)2ml与水适量使成25ml，加硫代乙酰胺试液2ml，放置2分钟后，与标准铅溶液一定量按同法制成的对照液比较（置白纸上，自上向下透视），以判断供试品中重金属离子是否超过限量。第一法适用于溶于水、稀酸和乙醇的药物，为最常用方法。,.,12,3）讨论（1）适宜目视比色范围为每25ml溶液中含10g-20g的Pb，相当于每1ml含10gPb的标准铅溶液1ml-2ml。（2）溶液的pH值在3-3.5，硫化铅沉淀较完全。用醋酸盐缓冲液（pH3.5）控制溶液pH值。（3）供试品如有色：在对照溶液管中滴加少量稀焦糖溶液或其它无干扰的有色溶液；取两倍量供试品，分成两等份，在一份中加硫代乙酰胺试液，用滤膜滤除金属硫化物沉淀后，加入标准铅溶液作为对照溶液，再与另1份供试溶液比较。,.,13,（4）铁盐存在微量高铁盐：加抗坏血酸或盐酸羟胺供试品中若有微量高铁离子存在，在弱酸性溶液中将氧化硫化氢而析出硫，产生浑浊，影响比色。可先加抗坏血酸0.51.0g，使高铁离子还原为亚铁离子，再按常规步骤检查。,.,14,重金属与有机药物结合怎么办？重金属不溶于酸水怎么办？重金属量很低怎么办？,重金属检查法,.,15,3.炽灼后的硫代乙酰胺法（第二法）适用于含芳环、杂环及难溶于水、稀酸及乙醇的有机药物。1）操作方法：精密称取规定量供试品置坩埚中，在电炉上缓缓炽灼至完全炭化，放冷，加硫酸0.5-1.0ml，使恰湿润，用低温加热至硫酸除尽，加硝酸0.5ml，蒸干，至氧化氮蒸气除尽后，放冷，在500-600（马福炉）炽灼使完全灰化，放冷，加盐酸2ml，置水浴上蒸干后加水15ml，微热溶解，转移入纳氏比色管，滴加氨试液至对酚酞指示液显中性，再加醋酸盐缓冲液（pH3.5）2ml，依第一法检查。,.,16,2）讨论（1）炽灼温度：温度太低，灰化不完全；温度太高，重金属损失越多，如铅在700经6小时炽灼，回收率仅为32%。应控制在500600炽灼使完全灰化。（2）炽灼残渣加硝酸加热处理后，必须蒸干除尽氧化氮，否则亚硝酸可使硫化氢氧化析出硫。（3）为了消除盐酸或其他试剂中可能夹杂重金属的影响，对照溶液应取同样、同量试剂在坩埚中蒸干后，依法检查。(空白试验)（4）含钠盐或含氟的有机药物在炽灼时能腐蚀瓷坩埚，应改用铂坩埚。,.,17,4.硫化钠法（第三法）适用于溶于碱性水溶液而难溶于稀酸或在稀酸中即生成沉淀的药物。操作方法：取规定量的供试品，加氢氧化钠试液5ml和水20ml使溶解后，加硫化钠试液5滴，再与一定量标准铅溶液经同样处理后的颜色进行比较。,.,18,司可巴比妥钠中重金属的检查取本品1.0g，依法检查（附录H第三法），含重金属不得过百万分之二十（20ppm）。硫化钠试液对玻璃有一定的腐蚀性。硫化氢试液有恶臭和毒性，不稳定，浓度也难以控制，应临用新配。,.,19,5.微孔滤膜法（第四法）,重金属限量低时，用纳氏比色管难以观察，用微孔滤膜滤过，重金属硫化物沉积于微孔滤膜上形成色斑，与一定量的标准铅溶液同法处理后产生的色斑比较，确定重金属是否超过限量。EUROPEANPHARMACOPOEIA6.0,(2008)HEAVYMETALSMETHODE,.,20,滤器上盖部分,连接头,滤器下盖部分,滤膜,垫圈,尼龙垫网,待测液注射器转移、压滤,微孔滤膜过滤法检重金属装置,.,21,第一法：硫代乙酰胺法，适用于溶于水、稀酸和乙醇的药物。第二法：有机破坏法，适用于含芳环、杂环以及难溶于水、稀酸、乙醇的有机药物。第三法：碱溶解法，适用于溶于碱性水溶液而难溶于稀酸或在稀酸中即生成沉淀的药物。第四法：微孔滤膜法，适用于含2-5g重金属杂质的检查。,重金属检查法,.,22,砷盐检查法LimitTestforArsenicsChP2010二部附录J,第二节一般杂质的检查方法,.,23,砷元素的危害,砷为毒性杂质，扩张毛细血管，麻痹血管舒缩中枢，使腹腔脏器严重充血，引起肝、肾、心等实质器官的损害。,（一）古蔡（Gutzeit）氏法原理利用金属锌与酸作用产生新生态的氢，与药物中微量砷盐反应生成具挥发性的砷化氢，遇溴化汞试纸产生黄色至棕色的砷斑，与一定量标准砷溶液所生成的砷斑比较，判定药物中砷盐的含量。其反应式如下：As3+3Zn+3H+AsH3+3Zn2+AsO33-+3Zn+9H+AsH3+3Zn2+3H2OAsH3+2HgBr22HBr+AsH(HgBr)2黄色AsH3+3HgBr23HBr+As(HgBr)3棕色,溴化汞试纸,醋酸铅棉花,反应液,标准品,样品,Gutzeit法检砷装置,A,B,C,标准砷斑的制备：精密量取标准砷溶液2ml(1g/ml)，置A瓶中，加盐酸5ml与水21ml，再加碘化钾试液5ml与酸性氯化亚锡试液5滴，在室温放置10分钟后，加锌粒2g，立即将装妥的导气管C密塞于A瓶上，并将A瓶置2540水浴中，反应45分钟，取出溴化汞试纸，即得。取按各品种项下规定方法制成的供试品溶液，置A瓶中，照标准砷斑制备方法操作，将供试品砷斑与标准砷斑比较，不得更深。,.,27,砷盐取本品2.0g，加水5ml溶解后，加稀硫酸5ml与溴化钾溴试液0.5ml，置水浴上加热约20分钟，使保持稍过量的溴存在，必要时，再补加溴化钾溴试液适量，并随时补充蒸散的水分，放冷，加盐酸5ml与水适量使成28ml，依法检查（附录J第一法），应符合规定（0.0001%）。,中国药典葡萄糖中砷盐的检查,Q1：供试品2.0g与标准砷溶液2ml形成的砷斑比较的做法(1)，供试品1.0g与标准砷溶液1ml形成的砷斑比较的做法(2)，哪个合适？,Q2：为何加碘化钾及氯化亚锡？,Q3：醋酸铅棉花的作用与注意事项,Q4：为何选用溴化汞试纸而不选用氯化汞试纸，注意事项有哪些？,（二）二乙基二硫代氨基甲酸银法(Ag-DDC法),原理砷化氢与Ag(DDC)吡啶溶液作用，使Ag(DDC)中的银还原为红色胶态银，与相同条件下一定量标准砷溶液所呈色用目视比色法或在510nm处测定吸收度，进行比较。,.,30,（三）次磷酸法原理在盐酸酸性液中，次磷酸将砷盐还原为棕色的游离砷，与一定量的标准砷溶液用同法处理后所显颜色比较，来控制药物中的砷限量。用于硫化物、亚硫酸盐及含锑药物等的砷盐检查时不产生干扰，但灵敏度比古蔡氏法低。,.,31,各国药典砷盐检查法ChP（2010）古蔡氏法、Ag（DDC）法Ph.Eur.(2008)古蔡氏法、次磷酸法USP（2009）Ag（DDC）法,.,32,溶液颜色检查法（ChP2010二部附录A）控制药物中有色杂质的含量。与标准比色液比较、分光光度法或色差计法。易炭化物检查法（ChP2010二部附录O）检查药物中遇硫酸易炭化或易氧化而呈色的微量有机杂质。溶液澄清度检查法（ChP2010二部附录B）澄清度是检查药品溶液的混浊程度，反映不溶性杂质的存在情况（特别是用作注射剂的原料药纯度控制）。,第二节一般杂质的检查方法,.,33,炽灼残渣检查法（ChP2010二部附录N）有机药物经炽灼炭化，至完全灰化，使非挥发性无机杂质（多为金属的氧化物或盐类）成为硫酸盐，称为炽灼残渣。(700-800)干燥失重测定法（ChP2010二部附录L）药物在规定条件下经干燥后所减失的重量，以百分率表示。主要控制药物中的水分，也包括其他挥发性物质如乙醇等。水分测定法（ChP2010二部附录M）药物中的水分包括结晶水和吸附水。ChP和USP均收载费休氏法和甲苯法测定药物中的水分。,第二节一般杂质的检查方法,.,34,残留溶剂测定法（ChP2010二部附录P）苯/benzenebp80.1氯仿/chloroformbp61.21,4-二氧六环/dioxanebp101.4二氯甲烷/dichloro-methanebp40.0吡啶/pyridinebp115甲苯/toluenebp110.6环氧乙烷/ethyleneoxidebp11种类多，毒性大，检测要求高。,.,35,残留溶剂测定法,确定残留溶剂的研究对象残留溶剂分类残留溶剂表示方法A.允许日接触量PDEB.浓度限度(%)=,.,36,药物中常见残留溶剂及其限度,第一类溶剂（毒性大且有致癌并对环境有害，避免使用）,.,37,第二类溶剂（对人有一定毒性，限制使用）,.,38,第二类溶剂,.,39,第二类溶剂,.,40,第三类溶剂（对人健康危险性较小，推荐使用）,.,41,第三类溶剂,.,42,第四类溶剂（尚无足够毒性资料的溶剂）1,1-二乙氧基丙烷1,1-二甲氧基甲烷2,2-二甲氧基丙烷异辛烷异丙醚甲基异丙基酮甲基四氢呋喃石油醚三氯乙酸三氟乙酸,.,43,残留溶剂测定法气相色谱法,1.色谱柱毛细管柱、填充柱2.系统适用性试验理论板数N不低于5000（毛细管柱）1000（填充柱）相邻峰分离度R大于1.5精密度RSD内标法不大于5%外标法不大于10%,.,44,残留溶剂测定法气相色谱法,3.供试品溶液的制备顶空进样0.1-1g供试品，水、DMF、DMSO溶液直接进样水或合适溶剂4.对照品溶液的制备水作溶剂或50%DMF、DMSO溶解后再用水逐步稀释限量检查：根据限量配制对照品浓度定量测定：接近供试品残留量的浓度,.,45,残留溶剂测定法气相色谱法,5.测定法第一法毛细管柱顶空进样等温法检查有机溶剂残留的数量不多，且极性差异较小的供试品第二法毛细管柱顶空进样系统程序升温法检查有机溶剂残留的数量较多，且极性差异较大的供试品第三法溶液直接进样法可采用填充柱，亦可采用适宜极性毛细管柱,.,46,示例,大孔树脂有机溶剂残留大孔树脂是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂的有机高分子聚合物,应用大孔树脂进行分离的技术是20世纪60年代末发展起来的继离子交换树脂后的分离新技术之一,物理化学稳定性高比表面积大吸附容量大选择性好吸附速度快,解吸条件温和再生处理方便使用周期长宜于构成闭路循环节省费用,.,47,溶剂残留的引入,大孔吸附树脂主要以苯乙烯、-甲基苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙腈等为原料加入一定量致孔剂二乙烯苯聚合而成,多为球状颗粒,直径一般在0.31.25mm之间,通常分为非极性、弱极性和中极性。主要存在正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯（对于树脂的检测）洗脱过程采用不同比例的乙醇，因此也存在乙醇的残留（主要存在于产品中）,.,48,乳癖消原料药（提取物）中有机溶剂残留的测定,乳癖消原料药的制备取昆布、漏芦等14味药材按处方比例称取后加水煎煮两次，合并两次提取液滤过，滤液减压回收浓缩，上样D-101大孔树脂，静止吸附，采用梯度洗脱：水20乙醇75乙醇。收集醇洗部分，减压回收乙醇后喷雾干燥，成细粉。可能残留的溶剂乙醇第三类溶剂，限度0.5,.,49,实验部分,色谱条件仪器：岛津GC-14B气相色谱仪色谱条件：SIMPLICITY-530m0.32mm0.25m毛细管柱FID检测分流比30:1，进样量1l。进样分析开始毛细管60恒温6min，而后程序升温40C/min至200C，并维持1min。,.,50,实验部分,系统适用性试验：理论塔板数以乙醇、正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、苯乙烯和二乙烯苯色谱峰计算应不低于5000；乙醇、正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、苯乙烯和二乙烯苯与内标物正庚烷的色谱峰分离度应大于1.5；以内标法测定时，所得待测物与内标物色谱峰面积之比的相对标准偏差应不大于5%。,.,51,tR5.355对二甲苯tR5.982苯乙烯tR9.008、9.0979.338、9.462二乙烯苯,tR2.170乙醇tR2.410正己烷tR2.682苯tR2.845正庚烷（内标）tR3.487甲苯,.,52,乙醇、正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯和正庚烷气相色谱分离系统评价,线性范围与最低检测限,取标准曲线线性方程制备项下的最低浓度标准溶液，通过不同比例稀释后进行测定，在信噪比值约为3的条件下，最后一次测得积分值的浓度为最低检出浓度，其中乙醇最低检测限约为5.190g/ml,线性范围与最低检测限,乙醇标准曲线线性方程(n=5)Y=-0.0024+0.0029Cr=0.9999正己烷标准曲线线性方程(n=5)Y=0.0159+0.0048Cr=0.9997苯标准曲线线性方程(n=5)Y=-0.000016+0.0077Cr=0.9998甲苯标准曲线线性方程(n=5)Y=0.0009+0.0055Cr=0.9999对二甲苯标准曲线线性方程(n=5)Y=0.0037+0.005Cr=0.9999苯乙烯标准曲线线性方程(n=5)Y=0.0024+0.0044Cr=0.9999二乙烯苯标准曲线线性方程(n=5)Y=0.006+0.0063Cr=0.9999,最低检测限乙醇约为5.190g/ml正己烷约为5.380g/ml苯约为0.7350g/ml甲苯约为5.000g/ml对二甲苯约为5.420g/ml苯乙烯约为6.340g/ml二乙烯苯约为6.400g/ml,.,55,精密度试验(重复性),取上述标准溶液系列中的4号标准溶液，按气相色谱测定条件连续进样5次，计算乙醇、正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯和内标物正庚烷的峰面积比值,5,.,56,样品测定,取3个批号的样品1.21.3g，用N,N-二甲基甲酰胺超声溶解，过滤，收集滤液，并定容至50ml容量瓶内，上机测定比值浓度（g/ml）限量（）对照0.061320.25批号10.045314.960.062（1.213g）批号20.049816.450.067（1.226g）批号30.055318.270.073（1.247g）实际样品中主要残留的是乙醇,.,57,第三节特殊杂质检查检查药物中存在的微量杂质，首要的问题是选择一个专属性强的方法。一、利用药物和杂质在物理性质上的差异二、在化学性质上的差异三、在色谱性质上的差异四、在光谱性质上的差异,.,58,一、色谱分析法,色谱法具有高分离效能，专属性强，是检查有关物质的首选方法。TLCHPLCGC,.,59,TLC1.杂质对照品法制备一定浓度的供试品溶液和相应的(浓度符合限度规定的)杂质对照品溶液或系列杂质对照品溶液，点样、展开、检测并比较。供试品溶液色谱图中除主斑点外的其他斑点(杂质斑点)与相应的杂质对照品溶液或系列杂质对照品溶液色谱图中的主斑点比较，颜色(或荧光)不得更深。,.,60,TLC2.自身稀释对照法制备一定浓度的供试品溶液；取供试品溶液一定量，按照限度规定，稀释制成另一低浓度溶液或系列溶液，作为对照溶液，点样、展开、检测并比较。供试品溶液色谱图中除主斑点外的其他斑点(杂质斑点)与相应的自身稀释对照溶液或系列自身稀释对照溶液色谱图中的主斑点比较，颜色(或荧光)不得更深。,.,61,TLC3.杂质对照品法与自身稀释对照法并用即特定杂质限度采用杂质对照品法，其他杂质限度采用供试品溶液自身稀释对照法控制。通常应规定杂质的斑点数和单一杂质量，当采用系列自身稀释对照溶液时，也可规定估计的杂质总量。,.,62,4.对照药物法当无适合的杂质对照品或供试品中杂质斑点颜色与主成分斑点的颜色有差异，难以判断其限量时，可用与供试品相同的药物作为对照品，此对照药物中所含待检杂质需符合限量要求，且稳定性好。ChP采用TLC检查马来酸麦角新碱中的有关物质样品溶液：供试品溶液（1）5mg/ml、供试品溶液（2）0.2mg/ml，对照品溶液5mg/ml；试验结论：供试品溶液（1）主斑点的位置和颜色应与对照品溶液的主斑点相同；如显杂质斑点，其颜色与对照品溶液对应的杂质斑点比较，不得更深，并不得显对照品溶液以外的杂质斑点；供试品溶液（2）除主斑点外，不得显任何杂质斑点。,.,63,HPLC,高效液相色谱法分离效能高、专属性强和检测灵敏度高，可以准确地测定供试品各组分的峰面积，在杂质检查中的应用日益增多。特别是选择HPLC测定含量的药物，可采用同一色谱条件进行杂质检查。,.,64,1.峰面积归一化法,样品峰,溶剂峰,ChP采用HPLC法对胰岛素中相关蛋白质的检查，按面积归一化法计算，A21脱氨胰岛素不得大于5.0%，其他相关蛋白质不得大于5.0%。,.,65,2.不加校正因子主成分自身对照法3.加校正因子的主成分自身对照法,样品液稀释,样品液,溶剂峰,样品峰,.,66,HPLC,不加校正因子的主成分自身对照法ChP采用HPLC法对头孢克肟中有关物质的检查，采用不加校正因子的主成分自身对照法，即供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍（0.5%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的3倍（3%），供试品溶液色谱图中任何小于对照溶液主峰面积0.1倍的峰可忽略不计。,.,67,HPLC,加校正因子的主成分自身对照法ChP采用HPLC法对红霉素中红霉素B、C组分及有关物质的检查，采用加校正因子的主成分自身对照法，即红霉素B按校正后的峰面积计算（乘以校正因子0.7）和红霉素C峰面积均不得大于对照溶液主峰面积（5.0%）。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，红霉素烯醇醚、杂质1按校正后的峰面积计算（分别乘以校正因子0.09、0.15）和其他单个杂质峰面积均不得大于对照溶液主峰面积的0.6倍（3.0%）；其他各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积（5.0%），供试品溶液色谱图中任何小于对照溶液主峰面积0.01倍的峰可忽略不计。,.,68,样品峰,杂质峰,杂质对照品,4.杂质对照品法测定杂质含量,ChP采用HPLC法对二羟丙茶碱有关物质中茶碱的检查，按外标法以峰面积计，不得过0.5%。,.,69,示例,头孢克肟中有关物质检查取含量测定项下的样品溶液1ml，用pH7.0的磷酸缓冲液稀释定容至100ml，制成浓度为样品溶液的1/100的对照溶液,.,70,HPLC,取对照溶液20l注入液相色谱进行预试，调节灵敏度，使主成分峰的峰高约为满量程的2025，与含量测定项下的供试品溶液比较，供试品溶液的色谱图中如果有杂质峰（溶