影响脱分化和再分化的因子

第四章影响植物细胞脱分化和再分化的因子,董雯生物技术教研室,植物离体培养中，影响植物细胞脱分化和再分化的因子有外因和内因两个方面。,外因,环境条件,营养条件,内因,生理状态,遗传性,4.1培养基的影响,4.1.1培养基的营养成分（四大类）无机盐混合物类有机物类植物激素类天然复合物类,无机盐混合物类：提供植物细胞的无机营养，维持培养基的酸碱度和渗透压。（1）大量元素植物脱分化、再分化形态建成，需要量较大的的一类元素。包括N、P、K、S、Ca、Mg等。硝态氮和铵态氮的应用比例，可根据植物的类别灵活调用。（2）微量元素与植物代谢有密切关系。常用：Fe、Mn、Zn等。用量虽少，但是作用不小。,有机物类：（1）碳水化合物：细胞碳源和能源，也调节培养基的渗透压。（2）维生素类（3）有机氮源：氨基酸和酰胺类，对细胞的脱分化、再分化器官建成都起重要作用。,植物激素类1.常用激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素（1）生长素类在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面，根对生长素最敏感。活性：2，4DNAAIAA浓度范围：0.115mg/L,（2）赤霉素主要用于刺激在培养中形成的不定胚发育成小植株，促进幼苗茎的伸长生长。此外，赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化。此外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。常用GA3,（3）细胞分裂素类培养基中添加细胞分裂素有三个作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长，细胞分裂素与生长素相互作用，当组织内细胞分裂素生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用。活性：ZTBAKT浓度范围：0.110mg/L,2.激素的应用规律：离体培养时，在生长素存在的条件下，细胞分裂素的作用有加强的趋势，不过两者在使用上有一定的顺序关系，由于处理的顺序不同，会影响培养物器官发生的方向。先生长素，后分裂素处理有利于细胞的分裂，但细胞不分化。先分裂素再生长素处理，细胞也分化。两者同时处理时，分化频率提高。但是两者同时处理时用量比值会改变形态建成的方向。,总之自然界植物的种类、品种繁多；离体培养时取材也是形形色色；培养目的也不尽相同，要想使植物激素的应用技巧“得心应手”使不容易的，唯一的办法就是多实践离体培养时，在使用外源激素时，还受到内源激素的干扰。目前对内源激素的测定尚无准确、简便的方法，故对能源激素难以做到定量、定性分析。因此在外源激素的应用上，还处于比较盲目的阶段。,天然复合物成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用，特别是新的生长调节物质不断产生，更缩小了它的使用范围。可是由于其对一些难以生长培养材料的特殊作用，所以在一些试验中还常常应用它。,4.1.2培养基的渗透压,4.1.2.1调节渗透压的意义渗透压是由培养基中的各种物质的总浓度决定的。也就是说，是由培养基中各种无机盐和有机物的总浓度决定的。培养细胞是通过细胞渗透来吸取来吸取营养的，当培养材料和培养基之间处于等渗时，或者培养材料的渗透压略低于培养基渗透压时，培养材料才能从培养基里汲取养分和水分。,4.1.2.2渗透压调节物质糖对培养基渗透压起决定性作用。4.1.2.3糖的种类与糖浓度种类：蔗糖、葡萄糖、果糖等浓度控制：植物材料不同不同培养目的培养方式不同,4.1.3培养基的酸碱度,4.1.3.1调节培养基酸碱度意义植物是自养的，它有自体调节机制。而离体的材料失去了这一能力，只能人工调节。方法：1）用pH测定计直接测定2）用pH试纸比色测定,4.1.3.2培养基pH调节的依据1）按照植物长期生活所处环境的酸碱度进行调节2）依据培养基硬度来决定一般来说当pH高于6.5时，培养基全变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固3）依据培养基中某些物质的稳定性（Fe、赤霉素等）,不同植物的最适p值,4.2环境条件,4.2.1湿度条件湿度的影响包括培养容器和环境的湿度条件。容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季应适当减少琼脂用量，否则将使培养基干硬，以致不利于外植体接触或插进培养基，导致生长发育受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，但封闭度较高的封口材料易引起通透性受阻，也导致生长发育受影响。,主要是培养瓶以外环境的相对湿度存在的间接影响。当外界相对湿度低于60时，培养基容易干涸，会改变培养基的渗透压。相反，当外界湿度过高时，培养室潮湿，具备了细菌和霉菌的滋长条件，会造成培养基和培养材料的污染。一般要求7080的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。,4.2.2温度条件离体培养下，培养温度与植物细胞脱分化、细胞分裂和再分化有着密切的关系。大多数植物都是在2327之间进行，一般采用252。低于15时培养，植物组织会表现生长停止，高于35时对植物生长不利。但是，不同的植物材料对不同的温度反应是不一样的。不同培养目标采用的培养温度也不同。,4.2.2.1离体培养条件下温度控制的原则主要依据：植物的起源和生态类型喜温性植物：2628冷凉性植物：1822或25再细胞进行脱分化阶段（诱导期）和愈伤组织增殖期（分裂期），对温度的要求较高；而在器官发阶段（分化期）要求低些。,4.2.2.2培养周期中的昼夜温差恒温培养还是变温培养？,4.2.2.3低温处理在花药离体培养前后，实施低温预处理，可以促进细胞的脱分化和再分化。现已成为一种有效的诱导措施。特别是在花药和花粉培养方面。,4.2.3光照条件光的影响包括：光周期（黑暗与光照交替的时间）光量（光照强度）光质（光的波长）,4.2.3.1光周期试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，最常用的周期是16小时的光照，小时的黑暗，研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，有时需要暗培养，尤其是一些植物的愈伤组织在暗下比在光下更好。是否需要光周期调节是根据不同的植物及不同培养目的来进行选择的。愈伤组织诱导阶段器官发生阶段,4.2.3.2光量光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植物体、细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。,4.2.3.3光质光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。离体培养中根芽分化的有效光谱成分不同。芽的分化有效光谱：蓝紫光419540nm根的分化有效光谱：红光600680nm,4.3供体遗传性和生理状态,4.3.1供体植物的遗传性与器官发生基因型不同，形态建成能力有差异。这种差异表现在：种与种之间同一种的不同亚种之间纯种与杂种之间,4.3.2供体生理状态1.生理年龄：年龄较幼的外植体，不仅易于诱导形