section--蛋白质组学PPT课件

.,1,前言,蛋白质组学是当今生命科学的六大研究热点之一人类基因组计划（humangenomeproject,HGP）工作目标：测定人类细胞23对染色体上大约3109bp的核酸序列。HGP1990年正式启动，于2001年发表了人类基因组框架图。后基因组时代，也称为功能基因组时代。蛋白质组的研究成为后基因组计划的核心内容之一。2001.2，人类蛋白质组(HUPO)成立。,.,2,一、蛋白质组学研究的历史、背景和相关概念：,（一）基因组、基因组学与后基因组计划：基因组(genome)：细胞或生物体的一套完整的单倍体遗传物质，是所有不同染色体上全部基因和基因间的DNA的总和。基因组学（genomics）：是研究基因组的科学。包括遗传图（geneticmap）、物理图（physicalmap）、序列图（sequencemap）和基因图（genemap）构建方法等。基因组学主要探讨基因组的结构特点，也称为结构基因组学（structuralgenomics）。,.,3,后基因组计划(post-genomeproject)：HGP完成后，人们又提出了进一步的探索计划，以探讨基因的功能为目的。研究内容也称为功能基因组学。功能基因组学的研究角度：1基因组多样性的研究：阐述功能基因多态性对机体的影响。2比较基因组以及功能缺失突变的研究：观察基因表达被阻断后（基因敲除）在细胞和整体所产生的表型变化。3药物基因组学研究：选择药物起效、活化、排泄等相关过程的候选基因进行研究，分析、确定基因序列的变异（突变）与药物的关系等。4.基因组的表达及其调控：基因转录表达谱及其调控，蛋白质组研究，生物信息学的应用。,.,4,（二）蛋白质组学,转录子组（transcriptome）:一个细胞在特定生理或者病理状态下表达的所有种类的mRNA。蛋白质组（proteome）由一个细胞，一个组织或一种生物的基因组所表达的全部相应的蛋白质。蛋白质组是一个动态的概念。蛋白质组学（Proteomics），它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。蛋白质组学研究的开展是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑,.,5,二蛋白质组学研究的策略和范围：,（一）研究策略：竭泽法：采用高通量蛋白质组研究技术分析生物体内近乎所有蛋白，是从大规模、系统性的角度看待蛋白质组学。功能法：研究不同时期细胞蛋白质组成的变化和在不同环境下的差异表达，以发现有差异蛋白质的种类为主要目标。（二）研究范围蛋白质的表达模式；蛋白质翻译后修饰研究；大规模蛋白质之间的相互作用；作用网络和复合体组成分析,.,6,三蛋白质组学研究技术基本流程：,.,7,（一）蛋白质组研究中的样品的制备体系：,1蛋白质组样品的全息制备：策略：根据溶解性、在不同细胞器定位进行样品预分级。注意：材料新鲜，低温、防污染、防降解和蛋白修饰一般流程：长至80%密度的培养细胞（或均一的动植物组织样品），用预冷的PBS缓冲液清洗三次以上按照1106细胞加入50L裂解液（8mol/L尿素，4%CHAPS，40mmol/LTris，65mmol/LDTT）超声处理，处理时间5s，间歇10s，功率100120W，直至溶液澄清无粘稠物为止。4C，离心，25,000g1h取上清液测定蛋白质浓度，分装后-70C保存,.,8,2亚细胞蛋白质组样品制备：亚细胞蛋白质组学（subcellularproteomics）：针对细胞不同区域的蛋白质组学研究,如特定细胞器、多蛋白复合体等亚细胞蛋白质组学的技术：亚细胞组分的分离纯化技术和蛋白质组技术两大方面。亚细胞器分离：差速离心法+蔗糖密度梯度离心法自由流电泳技术其它分子细胞生物学技术多蛋白组合体的分离：免疫共沉淀法；亲和层析技术亚细胞蛋白质组学意义：富集低丰度蛋白;完善全细胞蛋白质组，提供蛋白质的亚细胞定位信息；亚细胞蛋白质组的差异表达谱，可灵敏地反映出病理因素造成的蛋白质的量变、质变和蛋白质迁移情况，在细胞生物学研究中表现出特殊的意义。,.,9,（二）蛋白质组研究中蛋白质的分离技术：,1双向凝胶电泳(2-DE)分离技术：原理：先采用等电聚焦方法根据蛋白质的等电点差异进行第一向分离，再根据蛋白质分子量的大小进行SDS-PAGE第二向分离。分辨率：一般解析到20003000个蛋白质点，从高通量常规凝胶多达10000种蛋白质。,.,10,步骤：(1)一维等电聚焦电泳(IEF)IEF凝胶的制备：载体两性电解质(sytheticcarrierampholyte，SCA)为介质固相pH梯度技术(immobilizedpHgradient,IPG)加样：利用加样杯，边运行等电聚焦，边上样将样品与重泡胀液混合，在IPG胶条泡胀的同时样品也渗入胶条IEF电泳(2)二维SDS-PAGE：平衡IEF胶，使一向胶上的蛋白质变性（SDS);SDS-PAGE(3)染色(显色):根据具体条件选择,.,11,.,12,隐藻PC蛋白的IEF图谱,2双向凝胶电泳图谱的图像分析,第二向SDS-PAGE（考染）,.,13,鼻咽癌细胞系CNE-2双向电泳银染图谱,.,14,通常必须借助专门的计算机软件，常用的如PDQuest。,1看图和解释：对图像进行处理，切割、去背景，和转换为数据。密度工具还可看到整张图上斑点的光密度值变化等。2点的检测和定量：测定出每个点的相对分子量和等电点等信息。3凝胶匹配：根据不同的目的做出不同的匹配组（matchest），然后将他们整合成标准。匹配过程中需要人工设定一些参考点（landmark）。4数据归类：PDQuest可将凝胶上的点做数据处理，包括定量、定性、任意（arbitrary）、布尔(boolean)、统计和解释(annotation)六组方式。5报告输出：数据可以列表输出。,.,15,3蛋白分离技术的改进和非凝胶电泳技术,三步提取法:采用三种不同的提取液对细胞中蛋白进行预分离，增加了溶解性能不同的第三维分离。利用分子扫描仪进行蛋白质鉴定的技术，利用涂有酶解液的膜，在双向凝胶转膜的同时进行酶切，再利用质谱进行鉴定。IEF电泳直接与基质辅助激光解析质谱（MALDI）联用，代替SDS-PAGE测定一向胶条中蛋白质的相对分子量。其它技术：离子交换、分子筛法、高效液相色谱法(HPLC)、亲和层析色谱、毛细管IEF、毛细管电泳与质谱联用、柱层析、免疫沉淀、蛋白芯片以及蛋白质飞行质谱(SELDI)技术等,.,16,（三）生物质谱技术和蛋白质的鉴定,电喷雾离子化（elecrosparyionization,ESI）基质辅助激光解析离子化（matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI）,可测定Mr1015万的蛋白质，灵敏度可达pmol甚至fmol,.,17,质谱技术除了与2D-双向电泳技术联合应用之外，还可与其它技术联用：液相色谱-质谱（HPLC-ESI-MS）;串联质谱（tandemMS,MS-MS，MS/MS）等,.,18,四蛋白质组研究中的翻译后修饰分析：,1磷酸化蛋白质组研究：人类基因组中有2%的序列用于编码磷酸化蛋白真核生物中主要的磷酸化方式有三种：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化，比例是：1800:200:1关键：富集磷酸化蛋白质制备磷酸化的蛋白的抗体,免疫共沉淀富集磷酸化蛋白质固定化金属鳌合柱富集磷酸化肽段(IMAC)化学修饰法改变磷酸基团的化学性质，然后进行特异分离2D-电泳或HPLC纯化，进行磷酸化位点的各种质谱分析,.,19,.,20,2糖基化蛋白质组研究：,糖组（glycome）：细胞内所有糖链成分。糖组学（glycomics）：基本目标包括寻找编码糖蛋白的基因；寻找糖基化位点；解析糖链及糖基化肽段的结构；研究糖基化的功能等。真核生物中有50%以上的蛋白质被糖基化糖基化主要类型：N-糖基化；O-糖基化；糖基磷脂酰肌醇锚糖基化糖链完整序列的分析和测定往往是借助物理、化学各种方法反复组合。常用工具包括：质谱、核磁共振，结合酶、凝集素、化学修饰及断裂、放射标记等方法。,.,21,糖基化蛋白分析流程：,.,22,五蛋白质相互作用研究,1.蛋白质的相互作用包括三个方面：多亚基蛋白质的形成，即分离纯化后可得到两个或多个不同组分，例如血红素，大肠杆菌DNA合成复合体等。多成分的蛋白质复合物，如核孔复合物、剪接体、纺锤体等，成分相对固定。瞬时的蛋白质相互作用，几乎参与调节细胞内基本生命活东的所有形式。例如所有蛋白质修饰过程;转录复合体与特定启动子的结合、蛋白质的跨膜过程、新生肽链的折叠等。始终是动态的、变化的。,.,23,2.蛋白质的相互作用研究方法：,传统的方法：如蛋白质亲和层析、免疫共沉