基因工程中常用的酶查笑君PPT课件

.,1,一、限制性核酸内切酶二、连接酶三、聚合酶四、修饰酶,.,2,基因的剪刀,-限制性内切酶,第一节限制性核酸内切酶(Restrictionenzyme),.,3,核酸酶（P41-42)：切割相邻的两个核苷酸残基间的磷酸二酯键导致多核苷酸链共价键断裂的一类水解酶。可分为核糖核酸酶与脱氧核糖核酸酶。按水解断裂核酸分子的不同方式分：核酸外切酶：以核酸的末端为酶解部位逐个降解核苷酸核酸内切酶：从核酸内部水解磷酸二酯键使之断裂限制性核酸内切酶，简称限制酶,.,4,一.限制与修饰发展史:1962年Arber,W.(瑞士)等提出限制与修饰假说。1968Meselson和Yuan发现型限制性酶。1968Smith和Wilcox发现了类限制性酶并阐明其性质。1971Nathans等首次制作酶切图谱。因他们发现了限制性酶并应用于分子遗传学而获1978年度诺贝尔生理学和医学奖。,.,5,1962,Arber,1968Smith等发现限制性酶,W.Arber(1929)H.O.Smith(1931)BiozentrumderUniversittBasel,JohnsHopkinsUniversitySchoolSwitzerlandofMedicine,USA,.,6,寄主控制的限制与修饰作用：,.,7,感染过A菌的噬菌体进入B几乎总是被切成小片断的现象，称限制。寄主使它再次感染时能够有效生长而没有收到限制的现象，称修饰。,.,8,二.限制性内切酶的类型（P44）,基因工程中最常用的是型酶,.,9,二.型酶的命名,书写与剪切方式：限制酶来源剪切方式EcoRIEscherichiacoliRY13GAATTCPstIProvidenciastuartii164CTGCAGBseBacilusstearothermophilusstrain822(Hpa)GTTAACEcoR(E：属名；co：种名；R：株；：发现次序),.,10,ClaNcoNdeNotSacXbaXho,有些内切酶来源于无菌株名的细菌,.,11,型内切酶识别位点序列中心对称,5GAATTC3,3CTTAAG5,EcoR,.,12,酶切位点及酶切未端,平未端,5GATATC3,3CTATAG5,EcoR,5GATATC3,3CTATAG5,.,13,EcoR(5GATATC3)Hinc(5GT(T/C)(A/G)AC3)Hind(5GT(T/C)(A/G)AC3)Sca(5AGTACT3)Sma(5CCCGGG3),.,14,具5突出未端的粘性未端,5GAATTC3,3CTTAAG5,5G35AATTC3,3CTTAA53G5,EcoR,.,15,BamH(5GGATCC3)EcoR(5GAATTC3)Hind(5AAGCTT3)Nco(5CCATGG3)Nde(5CATATG3)Not(5GCGGCCGC3)Sal(5GTCGAC3)Xba(5TCTAGA3)Xho(5CTCGAG3),.,16,具3突出未端的粘性未端,5GAGCTC3,3CTCGAG5,5GAGCT35C3,3C53TCGAG5,Sac,.,17,Kpn(5GGTACC3)Pst(5CTGCAG3)Sac(5GAGCTC3),.,18,识别同一序列且在同一位置(有时不)切割DNA的内切酶称为同裂酶Hinc(5GT(T/C)(A/G)AC3)Hind(5GT(T/C)(A/G)AC3)Sma(5CCCGGG3)Xma(5CCCGGG3),同裂酶,.,19,来源和识别都不同，但酶切产生相同末端的内切酶称为同尾酶专指产生粘性未端的内切酶,同尾酶,.,20,5GGATCC3,3CCTAGG5,BamH,5G3,3CCTAG5,5AGATCT3,3TCTAGA5,Bgl,5GATCT3,3A5,T4DNALigase,5G,3CCTAG,GATCT3,A5,连接处不再是内切酶识别序列,.,21,BamH/BglSal/XhoSpe/Xba,.,22,三、限制酶的识别序列与DNA的切割（P47）,1、限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不具有种的特异性；2、限制酶识别序列的长短涉及对DNA分子切割的频率，可以从理论上推导酶切DNA片段的大小；作用于同一种DNA分子，识别序列短的出现概率大，酶切DNA片段小。识别位点：4个碱基：44=2566个碱基：46=4096,.,23,3、限制酶识别序列的相邻序列效应（P48）：即大多数限制性内切酶对只含识别序列的寡核苷酸没有催化活性，需在两侧各延长一个或几个核苷酸才能被有效酶切。应用：设计引物时加保护碱基。,.,24,4、限制酶的位点偏爱性(p48):限制性核酸酶的切割效率与酶切位点侧翼序列的核苷酸组成有关。这是一些限制性内切酶酶切效率不高的原因。例如：在实验过程中，经常会发现HindIII、XbaI等酶活性较低。应用：涉及局部消化时应考虑使用这些酶。例如，构建基因组文库时，需要对基因组DNA进行不完全酶切。,.,25,5、星活性(P48),正常条件下EcoR识别5-GAATTC-3,当处于低盐(8.0)或高甘油(50%)时识别5-AATT-3；星活性是指某些限制性核酸内切酶在不适的环境中其识别序列发生改变的现象。,.,26,四.影响限制性核酸内切酶活性的因素(P49),1底物DNA的纯度,在DNA制剂中的某些物质，如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸（EDTA）、SDS（十二烷基硫酸钠）、以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸内切酶的活性。,.,27,解决办法：A.增加限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。B扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应的稀释。C延长酶催化反应的保温时间。,.,28,2底物DNA的甲基化程度解决办法：更换缺失了甲基化酶的菌株选择同裂酶,.,29,3酶切消化反应的温度一般内切酶的反应温度为37特例：SmaI:25TaqI:65MaeI:45,.,30,4酶切缓冲液成分：MgCl2、Tris-HCl、-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）以及牛血清蛋白（BSA）酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。Tris-HCl的作用，在于使反应混合物的PH恒定在酶活性所要求的最佳数值的范围之内。疏基试剂对于保持某些限制酶的稳定性可能是有用的，但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性。有一部分限制酶对于钠离子或钾离子浓度变化反应十分敏感，而一部分限制酶则可适应较广的离子强度变化幅度。操作中注意事项：合适的温度；内切酶的用量不超酶切总体积的1/10,.,31,酶切反应,酶(多数已商品化,以10u/l溶液形式提供)反应缓冲液(以5倍或10倍母液随酶提供)反应时间:随DNA及酶用量而定,一般数小时至过夜,.,32,第二节DNA连接酶,.,33,核酸酶是“剪刀”连接酶就是“浆糊”、“胶水”,.,34,一.连接酶(DNAligase)在E.coli和动植物细胞中都有此酶。能催化DNA中相邻的3-OH和5-P之间形成磷酸二脂键。(P51),.,35,连接酶的功能：(1)能封闭DNA双链或RNA/DNA杂种双链中的单链缺口，而不能封闭双链RNA中的单链缺口(2)能封闭粘性末端退火后出现的缺口；DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的缺口（nick）,而不能封闭裂口（gap）。用途：(1)通过粘端连接DNA分子；(2)连接平端双链DNA分子或平端DNA与人工接头的连接。,.,36,基因工程的操作过程,切,接,转,增,检,.,37,DNA连接酶的发现1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶(1igase)。这种酶需要在一条DNA链的3，末端具有一个游离的羟基(OH)，和在另一条DNA链的5，末端具有一个磷酸基团(P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用,.,38,在大肠杆菌及其它细菌中，DNA连接酶催化的连接反应，是利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)作能源的；而在动物细胞及噬菌体中，则是利用ATP腺苷三磷酸作能源。DNA连接酶并不能够连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的链必须是双螺旋的一部分。实际上，DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的缺口(nick)，即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂。,.,39,.,40,.,41,分类：用于共价连接DNA限制片段的连接酶有两种不同的来源：一种是由大肠杆菌染色体编码的叫做DNA连接酶。另一种是由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的叫做T4DNA连接酶。这两种DNA连接酶，除了前者用NAD+作能源辅助因子，后者用ATP作能源辅助因子外，其它的作用机理并没有什么差别。,.,42,连接酶连接缺口DNA的最佳反应温度是37。但是在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的。因此，连接粘性末端的最佳温度，应是界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为6比较合适,.,43,粘性末端DNA片段的连接3.1粘性末端的连接DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组的DNA分子。应用DNA连接酶这种特性，可在体外将具有粘性末端的DNA限制片段，插入到适当的载体分子上，从而可以按照人们的意图构建出新的DNA杂种分子。具粘性末端的DNA片段的连接比较容易，也比较常用。,.,44,.,45,3.2平末端DNA片段的连接不具有粘性末端的DNA分子也可以被连接起来。连接这种平末端DNA分子的方法有4种，（1）直接用T4DNA连接酶连接；（2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接；（3）用衔接物连接平末端DNA分子；（4）DNA接头连接法。,.,46,（1）直接用T4DNA连接酶连接T4DNA连接酶除了能够封闭具有3，一OH和5一P末端的双链DNA的缺口之外，在存在ATP和加入高浓度酶的条件下，它还能够连接具有完全碱基配对的平末端的DNA分子。这种反应的原因目前尚不清楚。但平末端连接效率不高。,.,47,（2）同聚物加尾连接平末端DNA片段运用末端核苷酸转移酶，能够将核苷酸(通过脱氧核苷三磷酸前体)，加到DNA分子单链延伸末端的3，一OH基团上，它并不需要模板链的存在，它一个一个加上核苷酸，构成由核苷酸组成的尾巴，长度可达100个核苷酸。,.,48,(3)用衔接物连接平末端DNA分子如果重组体DNA是用T4DNA连接酶的平末端连接或是用同聚物加尾构建的，那么就无法用原来的限制酶作特异的切割，因此也不能获得插入DNA片段。为了解决这个问题，可采用衔接物法提供必要的序列，进行DNA分子的连接。所谓衔接物(1inker)，是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。,.,49,（4）DNA接头连接法DNA衔接物连接法尽管有诸多方面的优越性，但也有一个明显的缺点，那就是如果待克隆的DNA片段或基因的内部，也含有与所加的衔接物相同的限制位点，这样在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也就会把克隆基因切成不同的片段，从而为后继的亚克隆及其它操作造成麻烦。当然，在遇到这种情况时，一个方法可改用其它类型的衔接物，另一种公认的较好的替代办法是改用DNA接头(adapter)连接法。,.,50,DNA接头(adapter)连接法于1978年由康乃尔大学吴瑞教授发明的。它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。,.,51,.,52,第三节.DNA聚合酶类,DNA聚合酶：催化以DNA为模板合成DNA的反应.特点:(1)以dNTPs作底物；(2)有模板存在；(3)有引物存在；(4)新链合成方向为53,.,53,.,54,一分子的核苷酸的3-位羟基与另一分子核苷酸的5-位磷酸基通过脱水可形成3,5-磷酸二酯键，从而将两分子核苷酸连接起来。,.,55,多核苷酸链：,核酸就是由许多核苷酸单位通过3,5-磷酸二酯键连接起来形成的不含侧链的长链状化合物。核酸具有方向性的长链状化合物，多核苷酸链的两端，一端称为5-端，另一端称为3-端。,.,56,1、DNA聚合酶I(DNApolymeraseI),DNApolI单链多肽，MW109kD,可被枯草杆菌蛋白酶切成两段：C-端大片断(Klenow酶)，MW67kD,具53聚合酶和35外切酶活性N-端小片断MW35kD,具53外切酶活性。(一)聚合酶活性：Mg2+DNAndNTPsDNA(pdN)n+nPPi5CCGOHMg2+5CCGATACC3GGCTATGG3GGCTATGG,条件：dNTPs和Mg2+；DNA模板；引物链,.,57,(二)外切酶活性(2)53外切酶活性:切补作用从游离的5端降解DNA，对DNA双链部分的磷酸二脂键有切除功能，每次切10nt5CGCATCTMg2+5CATCT3GCGCGTAGA3GCGCGTAGA(3)35外切酶活性:校对作用从游离的5端降解dsDNA和ssDNA5CGCATCTMg2+5CGC3GCG3GCG,.,58,核酸外切酶活性,35外切酶活性53外切酶活性,.,59,2、Klenow聚合酶5-3端的外切酶活性5-3端的聚合酶活性3、T4DNA聚合酶来源于被T4噬菌体感染的大肠杆菌，作用同上4、T7DNA聚合酶来源于被T7噬菌体感染的大肠杆菌，作用同上5、TaqDNA聚合酶耐高温,.,60,6.逆转录酶(reversetranscriptase),以RNA为模板的DNA聚合酶，来源于鼠（MLV）和禽类（AMV）的反转录病毒。由两条肽链组成，具有53聚合酶和RNaseH活性(见P55）。用途：(1)以RNA为模板合成cDNA,作为插入载体的目的基因或构建cDNA文库；(2)建立反转录PCR（RT-PCR)(3)以ssDNA或RNA为模板合成杂交探针。,.,61,M-MLV反转录酶1)特点：依赖于RNA的DNA聚合酶活性；依赖于DNA的DNA聚合酶活性；不具内切酶活性;RNaseH活性低;2)与AMV反转录酶比较a合成短链cDNA(0.