饮料中微生物检测.pptVIP

第七章微生物的测定,含在饮料的检测中,一、分类,碳酸饮料(品)(汽水)类果汁(浆)及果汁饮料(品)类蔬菜汁及蔬菜汁饮料(品)类含乳饮料(品)类植物蛋白饮料(品)类瓶装饮用水类茶饮料(品)类固体饮料(品)类特殊用途饮料(品)类,总酸度、pH值、还原糖含量食品中微生物的检测细菌总数大肠菌群数食品添加剂的检测甜味剂糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜。防腐剂苯甲酸、山梨酸,二、微生物检验,1、细菌总数菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1g或1ml检样中所含细菌菌落的总数。它可以反应食品的新鲜度、被细菌污染的程度、生产过程中食品是否变质和食品生产的一般卫生状况等。因此它是判断食品卫生质量的重要依据之一。,流程,检样做成几个适当倍数的稀释液选择2-3个适宜稀释度各以1mL之量分别入灭菌平皿内每皿内加入46适量营养琼脂菌落数报告,（1）样品的无菌处理,以无菌操作，将检样25g（或25ml）剪碎以后，放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预先置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000r/min100000r/min的速度处理1min，做成1：10的均匀稀释液。,（2）稀释、接种,用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成1：100的稀释液。,琼脂培养基配方,蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15-20g蒸馏水1000ml,根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。稀释液移入平皿后，应及时将凉至46营养琼脂培养基可放置在（461）0C）水浴锅内保温注入平皿15ml，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。等琼脂凝固后，翻转平板，置（361）0C恒温箱内培养（482）h取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1g（1mL）样品所含菌落总数。,菌落计数方法,做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。平板菌落数的选择选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。,稀释度的选择,应选择平均菌落数在30300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。若有两上稀释度，其生长的菌落数均在30300之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字。若所有稀释度平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。,简便方法：菌落总数测定纸,使用方法,2、大肠菌群的测定,大肠菌群是指在37、24h能发酵乳糖，产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰式阴性无芽孢杆菌。大肠菌群数以每100ml（g）检样中大肠菌群最可能数（MPN）表示。,流程,乳糖胆盐发酵管变黄浑浊，,培养基配方,乳糖胆盐发酵双料:(1)蛋白胨40g(2)牛胆盐10g(3)乳糖20g(4)蒸馏水1000ml(5)溴甲酚紫（1.6g/t）2ml(6)PH值7.2-7.4,乳糖发酵管(1)蛋白胨20g(2)乳糖10g(3)蒸馏水1000ml(4)溴甲酚紫（1.6g/t）1ml(5)PH值7.2-7.4,伊红美蓝培养基：,成分：蛋白胨10g乳糖10g磷酸氢二钾2g琼脂17g2伊红水溶液20ml0.65美蓝水溶液13ml蒸馏水1000mlpH为7.1制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于热蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，121高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50-55，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。,伊红美兰琼脂平板划线培养大肠菌群的典型菌落,（1）深紫黑色，具有金属光泽的菌落（2）紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落（3）淡紫红色、中心色较深的菌落。,革兰氏染色阴性菌,纸片法,MPN表,阴性管数MpN95可信限100mL(g)1mL(g)，*30.1mL(g)*30.0lmL(g)*3下限上限000305001300023090003300103050116013001290013120续表阳性管数MPN95可信限100mL(g)1mL(g)30.lmL(g)x30.0lmL(g)X3下限上限020600219002212002316003090031130032160033190100405200101701021010211010315011070102301111103036011215011319012011030360121150122200123240130160131200132240133290200901036020114030370202200203260210150304402112007089021227021334o,革兰氏染色,革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：1）涂片固定。2）草酸铵结晶紫染1分钟。3）自来水冲洗。4）加碘液覆盖涂面染1分钟。5）水洗，用吸水纸吸去水分。6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。7）蕃红梁色液（稀）染10秒钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。,分光光度计使用方法,2使用方法（1）预热仪器将选择开关置于“T”，打开电源开关，使仪器预热20分钟。为了防止光电管疲劳，不要连续光照，预热仪器时和不测定时应将试样室盖打开，使光路切断。（2）选定波长根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的单色波长。（3）固定灵敏度档使用时，调到“1”挡。（4）调节T=0%轻轻旋动“0%”旋钮，使数字显示为“00.0”，（此时试样室是打开的）。（5）调节T=100%将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中的第一格内，并对准光路，把试样室盖子轻轻盖上，调节透过率“100%”旋钮，使数字显示正好为“100.0”。（6）吸光度的测定将选择开关置于“A”，盖上试样室盖子，将空白液置于光路中，调节吸光度调节旋钮，使数字显示为“.000”。将盛有待测溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格内，盖上试样室盖，轻轻拉动试样架拉手，使待测溶液进入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。读数后，打开试样室盖，切断光路。重复上述测定操作1-2次，读取相应的吸光度值，取平均值。（8）关机实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架用软纸擦净。3注意事项（1）为