DNA复制基础知识ppt课件.ppt

第四章DNA的复制Chapter4DNAReplication,1,第四章DNA复制DNAReplication,1引言-基因组复制与细胞分裂的关系2复制子3DNA复制的几种形式4DNA聚合酶5原核生物DNA复制的基本过程6真核生物DNA复制7DNA复制的调控8小结,2,重点内容：几个重要概念：DNA的复制、复制子、复制眼、复制叉、DNA聚合酶、DNA的半保留复制、DNA的半不连续复制、DNA的先导链、DNA的后随链、冈崎片段；不同生物基因组复制子数目；线性DNA复制末端问题的提出及解决方案；-复制、滚环复制及D-环复制的机制；大肠杆菌DNA聚合酶I、II、III的性质比较，DNA聚合酶与缺口平移法制备探针；DNA复制的起始、延伸及终止。了解内容：基因组复制与细胞分裂的关系；复制叉移动方向的确定；真核生物DNA聚合酶的种类及各自的功能；DNA复制的调控。,3,1引言-基因组复制与细胞分裂的关系,细胞在每次分裂的过程中，整个基因组都必须精确地复制一次。如何保证这一点？两个原则(1)DNA复制的启动决定了细胞的进一步分裂;(2)复制过程完成前，细胞是不会发生分裂的。,4,2复制子(replicon),2.1复制子的定义2.2不同生物复制子的数目2.3复制眼概念2.4复制叉概念及其移动方向的实验确定2.5复制的模式-起点、方向和速度,5,2.1复制子的定义,DNA中发生一次复制的单位称为复制子(replicon)。复制子是根据它含有复制所需的控制元件来定义的，在复制启动位点具起始点（origin)，在复制终止位点具终点（terminus)。起始点仅作用于所在复制子。注：在每个细胞周期中，每个复制子发生一次复制，且只发生一次。,6,质粒一般是一个自主环状的DNA基因组，构成一个独立复制子；原核生物基因组中一般只含一个复制子，在唯一的起始点启动就会引起整个基因组复制；真核生物基因组含多个复制子（一般40-100kb/个）。,2.2不同生物复制子的数目,7,2.3复制眼概念,复制眼：在一个长的未复制区域内DNA已经复制的区域,8,Replicationeye,9,复制叉:双螺旋DNA两条亲本链分开使复制能进行的部位。,2.4复制叉的概念及其移动方向的确定,10,复制叉移动方向的确定,放射性自显影法：对于大基因组内的不确定区域，两次连续的放射脉冲可以用来标记复制的移动。如果一个脉冲比另一个脉冲强，我们可以用相对的标记强度来区分，这些可用放射自显影观察。单向复制：在复制眼的一端，一种类型的标记后紧跟着另一种标记；双向复制：在复制眼的两端产生一种（对称的）模式。在真核生物中普遍存在。,11,2.5复制的模式-起点、方向和速度,单起点、单方向,多起点、单方向,单起点、双方向,多起点、双方向,12,3DNA复制的几种形式,3.1线性DNA双链的复制3.2环状DNA双链的复制,13,3.1线性DNA双链的复制,3.1.1线性DNA复制的具体表现3.1.2线性DNA复制时末端问题的提出3.1.3线性DNA复制时末端问题的解决方案,14,3.1.1线性DNA复制的具体表现,15,3.1.2线性DNA复制时末端问题的提出,所有已知的核酸聚合酶，无论是DNA聚合酶还是RNA聚合聚合酶都只从5端向3端移动，新链的合成方向与聚合酶移动方向一致，即只能是53；而对于DNA的合成必需一段引物的存在，体内DNA复制时，由一段RNA引物起始DNA合成，起始后它必须切除，切除后，5端如何起始呢？这就提出了线性DNA末端复制的问题。,16,17,复制能在新合成链的3端结束，它如何在5端启动呢？,18,3.1.3线性DNA复制时末端问题的解决方案,(1）通过将线性复制子转变为环状或多聚分子。如噬菌体：滚环产生多聚复制子）；(2）某种蛋白质可能会介入，在真正的末端上启动。几种线性病毒核酸具有与5端碱基共价结合的蛋白质，其中了解最清楚的例子是腺病毒DNA)。(3）DNA可形成特殊的结构，如在末端形成发夹。使分子没有游离末端。草履虫（Paramecium）的线性线粒体DNA的复制中就形成了一种交联；(4）末端是可变的，而不是精确确定的。真核生物染色体可能采用这种方式，在这种情况下，DNA末端的短重复序列的拷贝数改变（如端粒的复制）；,19,（1）通过将线性复制子转变为环状或多聚分子,20,TherollingcirclereplicatesDNA,Phage,21,Arollingcircleappearsasacircularmoleculewithalineartailbyelectronmicroscopy.,22,23,Adenovirusterminalproteinbindstothe5endofDNAandprovidesaC-OHendtoprimesynthesisofanewDNAstrand.,（2）某种蛋白质介入而在真正的末端启动复制,24,AdenovirusDNAreplicationisinitiatedseparatelyatthetwoendsofthemoleculeandproceedsbystranddisplacement.,（3）DNA末端形成特殊结构,25,AtypicaltelomerehasasimplerepeatingstructurewithaG-T-richstrandthatextendsbeyondtheC-A-richstrand.TheG-tailisgeneratedbyalimiteddegradationoftheC-A-richstrand.,（4）末端长度可变,26,AloopformsattheendofchromosomalDNA.,27,The3single-strandedendofthetelomere(TTAGGG)ndisplacesthehomologousrepeatsfromduplexDNAtoformat-loop.,28,Watchingflash,29,3.2环状DNA的复制,3.2.1-复制3.2.2滚环复制3.2.3D-环复制,30,3.2.1-复制replicationby-structure,31,3.2.2滚环复制replicationbyrollingcyclesstructure,X174噬菌体由一个单链环状DNA组成，这条链称为正（+）链；合成的互补链称为负（一）链。双链体的复制以滚环复制方式进行。,32,TheAproteiniscis-acting,PhageX174Thereplicationbyrollingcyclestructure,33,3.2.3D-环复制Replicationbydisplacementloopstructure,34,D-环复制（Replicationbydisplacementloopstructure),35,4DNA聚合酶,4.1大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能4.2真核生物DNA聚合酶的种类及其功能4.3DNA聚合酶所具有的共同结构,36,4.1大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能,SOS修复,37,4.1.1大肠杆菌DNA聚合酶I、II、III的性质比较,38,（1）DNA聚合酶I103kDa的单链多肽，可以被蛋白酶切成两段，C端的2/3包括聚合酶活性位点；N端的1/3包含核酸外切酶校正活性（一次可切除1-10个碱基）。（2）利用DNA聚合酶I进行缺口平移法制备探针的基本原理,4.1.2DNA聚合酶I与缺口平移法制备探针,39,Nicktranslationreplacespartofapre-existingstrandofduplexDNAwithnewlysynthesizedmaterial.,DNase,40,4.2真核生物DNA聚合酶的种类及其功能,41,42,真核生物由不同DNA聚合酶分别负责起始和延伸,三种细胞核DNA复制酶具有不同的功能:DNApolymerase起始新链合成DNApolymerase延伸先导链DNApolymerase可能与后随链合成有关，也可能具有其他功能,43,4.3DNA聚合酶所具有的共同结构,许多DNA聚合酶有一个由三个结构域组成的大裂隙，类似于手形。,44,ThecommonorganizationofDNApolymeraseshasapalmthatcontainsthecatalyticsite,fingersthatpositionthetemplate,athumbthatbindsDNAandisimportantinprocessivity,anexonucleasedomainwithitsownactivesite,andanN-terminaldomain.,45,5原核生物DNA复制的基本过程,5.1DNA复制的起始5.2DNA合成链的延伸5.3DNA复制的终止,46,5.1.1单链DNA的产生5.1.23-OH引发末端的产生5.1.3复制复合体的形成,5.1DNA复制的起始,47,5.1.1单链DNA的产生,解旋酶(helicase):使DNA的两条链分开，它通常利用ATP水解来提供必需的能量；,48,拓扑异构酶（DNATopisomerase）,拓扑异构酶的种类分为型和型。原核拓扑构酶：MW=100kD，单肽链，含34个Zn。作用是暂时切断一条DNA链，形成酶-DNA共价中间物而使超螺旋DNA松弛，然后再将切断的单链DNA连接起来。每次改变一个连环数。,49,原核拓扑构酶作用机制：酶与DNA结合使双链解旋；使一条链切开，但酶与切口的两端结合阻止了螺旋的旋转；酶使另一条链经过缺口，然后再将两断端连接起来；酶从DNA上脱落，两条链复原，得到的DNA比原来少一个负超螺旋。,50,拓扑异构酶拓扑异构酶也称旋转酶。广泛存在于各种生物中。使正超螺旋转化为负超螺旋，每次改变两个连接数。,51,52,单链结合蛋白（single-strandbindingprotein):单链DNA结合，阻止其再形成双链体状态,X174噬菌体的DNA在三种功能蛋白先后作用下分开成为单链：在复制起始点，噬菌体A蛋白使病毒（+）链产生缺口。Rep蛋白提供解旋酶活性，它使两链分离。SSB包绕单链形成稳定的单链形式。,ThreeproteinsunwindX174DNA,53,5.1.23-OH引发末端的产生,54,多种方法可以产生3-OH末端,1),3),2),55,起始需要解旋酶、单链结合蛋白和引发酶,5.1.3复制复合体的形成,56,5.2DNA合成链的延伸,5.2.1半保留复制合成两条新的DNA链5.2.2DNA的合成是半不连续的5.2.3连接酶将冈崎片段连接在一起5.2.4前导链和后随链的协调合成5.2.5DNA复制忠实性的控制,57,(1)半保留复制的概念,DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制(semiconsertivereplication)。,5.2.1半保留复制合成两条新的DNA链,58,(2)半保留复制实验证据（Meselson-Stahl),1958年Meselson&stahl用同位素（15N）示踪标记加密度梯度离心技术实验,该实验跟踪了生长了三代的大肠杆菌，证明了DNA是采取半保留的方式进行复制。,59,5.2.2DNA的合成是半不连续的（semidiscontinuousreplication),DNA复制在合成先导链（leadingstrand)时是连续的；而在合成后随链(laggingstrand)时是先形成小片段（Okazakifragment），随后再将它们连接而成大片段。因后随链是不连续合成的而先导链是连续合成的，所以我们称之为半不连续复制（semidiscontinuousreplication)。,60,两条新链具有不同的特征,ThetwonewDNAstrandshavedifferentfeatures,Okazakifragment,61,5.2.3连接酶（Ligase)将Okazakifragment连接在一起,62,5.2.4前导链(Leadingstrand)和后随链(laggingstrand)的协调合成,63,5.2.5DNA聚合酶控制复制的忠实性,64,DNA聚合酶造成的复制错误可分为两类：移码（frameshift):指一个核苷酸的插入或缺失。替换（substitution):指掺入错误核苷酸（不正确配对）Note:DNA聚合酶通常具有3-5核酸外切酶活性，可以切除错配碱基；通过校正机制，复制忠实性还可提高100倍。(10-310-8-10-10),65,细菌的DNA聚合酶仔细检查延长链末端的碱基对，如果是错误的会予以切除。,DNApolymeraseshaveexonucleaseactivity,66,修复会把含损伤碱基的一小段DNA替换掉,67,5.3DNA复制的终止,一般说来，链的终止不需要特定的信号，也不需要特殊的蛋白质来参与，到达终止位点后，DNA聚合酶离开DNA双链，终止发生。,68,真核生物DNA复制P47-48,7DNA复制的调控P48-50,69,8小结,复制子、复制眼、复制叉的概念线状DNA分子复制时末端问题的解决