课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

微生物的培养与应用,专题2,1、培养基据物理性质：液体培养基、固体培养基、半固体培养基据化学成分：天然培养基、合成培养基据用途/功能：选择培养基、鉴别培养基2、培养基的基本成分：碳源、氮源、水、无机盐特殊营养（生长因子）：维生素、碱基、氨基酸等3、无菌技术关键是防止外来杂菌入侵消毒：较温和的理化方法煮沸消毒、巴氏消毒、化学药剂消毒、紫外线消毒灭菌：较强烈的理化方法灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌4、配制培养基的流程计算称量溶化调pH、分装、封口灭菌倒平板5、接种平板划线法：连续划线，每次灼烧，逐步分散稀释涂布平板法:浸滴灼涂（梯度稀释，涂布平板）6、菌种保藏：临时保藏接种到固体斜面培养基，4长期保存甘油管藏。1ml甘油（灭菌）1ml菌液；20,温故而知新：课前2分钟背诵,比较消毒和灭菌,（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。,课题成果评价,微生物的培养,基础知识,实验操作,结果分析与评价,培养基,定义：,分类：,人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养物质,固体培养基,液体培养基,无菌技术,培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法,定义：,消毒与灭菌,常用灭菌方法,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,纯化大肠杆菌,课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,专题2微生物的培养与应用,1.从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,2.统计每克土壤样品中含有多少这样的细菌,CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3,课题背景,尿素CO(NH2)2重要的农业氮肥。尿素只有被土壤尿素细菌分解为NH3才能被植物吸收利用。,尿素分子的立体结构,一、研究思路,(一)筛选菌种,1、实例：寻找耐高温的DNA聚合酶,启示：,PCR技术：要求使用耐高温(930C)的DNA聚合酶。,寻找目的菌种时要根据它对_，到相应的环境中去寻找。,生存环境的要求,耐高温的酶,耐高温生物体,耐高温环境（热泉、火山口）,寻找,寻找,Taq细菌,筛选原因:因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。,2、实验室中微生物的筛选原理,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,思考：该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？,葡萄糖、尿素,一、研究思路,(一)筛选菌种,此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？,此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？,能（原则上）。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存。（此是选择培养基配方）,选择培养基：,在微生物学中，将允许_，同时_生长的培养基。,特定种类的微生物生长,抑制或阻止其他种类微生物,结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板等方法对它进行纯化培养分离。,如何对细菌进行计数？,（1）显微镜直接计数：,利用血球计数板(血细胞计数板）计数，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,2、实验室中微生物的筛选原理,一、研究思路,(一)筛选菌种,（2）稀释涂布平板法（间接计数）,（2）稀释涂布平板法（间接计数）,101,102,103,104,105,106,1、培养基据物理性质：液体培养基、固体培养基、半固体培养基据化学成分：天然培养基、合成培养基据用途/功能：选择培养基、鉴别培养基2、培养基的基本成分：碳源、氮源、水、无机盐特殊营养（生长因子）：维生素、碱基、氨基酸等3、无菌技术关键是防止外来杂菌入侵消毒：煮沸消毒、巴氏消毒、化学药剂消毒、紫外线消毒灭菌：灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌4、配制培养基的流程计算称量溶化调pH、分装、封口灭菌倒平板5、接种平板划线法、稀释涂布平板法6、菌种保藏：临时保藏接种到固体斜面培养基，4长期保存甘油管藏。1ml甘油（灭菌）1ml菌液；207、尿素细菌分解尿素：,温故而知新：课前2分钟背诵,CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3,看课本P22，并讨论你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,第一位同学：没有重复实验（至少涂布3个平板）第二位同学：A组结果误差过大，不应用于计算平均值,说明设置重复组的重要性。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。这个实例启示学生：在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,注意：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。,每克样品中的菌株数：（CV）MC：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V：涂布平板时所用的稀释液的体积（ml)M：稀释倍数,计算公式：,某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4,B,每克样品中的菌株数=（CV）M,(二)统计菌落数目,一、研究思路,(一)筛选菌种,(三)设置对照实验,阅读P2223页“（三）设置对照”一段讨论教材中提出的问题。,设置对照的目的：排除实验组中非测试因素对试验结果的影响，提高实验结果的可信度。,(1)A同学出现此结果的可能原因？,土样不同培养基污染(或混入了其他的含氮物质),(二)统计菌落数目,一、研究思路,(一)筛选菌种,(三)设置对照实验,阅读P2223页“（三）设置对照”一段讨论教材中提出的问题。,设置对照的目的：排除实验组中非测试因素对试验结果的影响，提高实验结果的可信度。,(1)A同学出现此结果的可能原因？,(2)设置对照实验，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素？,(2)设置对照实验，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素？,这个实例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明_；如果结果不同，则证明A同学存在_。,A无误,培养基的配制有问题,实验流程：,样品稀释涂布平板,微生物的培养与观察,菌落计数,二、实验设计,土壤取样,制备培养基,（一）土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,二、实验设计,（二）制备培养基,制备选择培养基（尿素为唯一氮源）制备牛肉膏蛋白胨培养基,（对照作用）,思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？,二、实验设计,（一）土壤取样,相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,23,（三）样品的稀释,这是因为：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,（二）制备培养基,二、实验设计,（一）土壤取样,（三）样品稀释涂布平板,稀释倍数为10106。每个稀释度均用3个选择培养基和1个蛋白胨培养基。,25,（四）微生物的培养与观察,（一）无菌操作1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。（二）做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。（三）制定计划,三、操作提示,1、培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落？,对照的培养皿无菌落说明培养基没有污染。牛肉膏培养基的菌落数目多余选择培养基的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。,2、获得某一稀释度下，菌落数30300的平板，在这以稀释度下是否至少有两个平板的菌落数相接近？,相接近，说明操作成功。,四、结果分析与评价,1、在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,2、测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红-美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。,课题延伸,本课题知识小结:,1.使用选择培养基的目的是（）A.培养细菌B.培养真菌C.使需要的微生物大量繁殖D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素,C,D,3.下列说法不正确的是（）A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶。B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值。C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）A.较多的氮源物质B.较多的碳源物质C.青霉素类药物D.高浓度食盐,B,C,再见！,1、涂布平板操作需要用到（）A.接种环、滴管、酒精灯B.接种环、移液管、酒精灯C.涂布器、移液管、酒精灯D.涂布器、接种环、酒精灯,C,2、在培养基中加入伊红和美蓝可以用来确定饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌，这种培养基称为()A选择培养基B鉴别培养基C液体培养基D固体培养基,B,3右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）右表培养基可培养的微生物类型是。,自养型微生物,（2）若除去成分，加（CH2O），该培养基可用于培养。（3）表中营养成分共有类。（4）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是。（5）右表中各成分重量确定的原则是。（6）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是。,固氮微生物,3,调整pH,依微生物的生长需要确定,琼脂（或凝固剂）,4关于微生物营养物质的叙述中，正确的是（）A、