《分子育种》PPT课件.ppt

第7章分子育种,基因工程育种原理定向进化理性设计非理性设计,2,本章重点,基因工程育种的主要步骤定向进化定点突变DNA重排基因组重排,3,本章难点,各种载体的结构和特点含重组质粒的细菌菌落的鉴定基因定点突变DNA重排基因组重排,4,第五节定向进化,定向进化（directedevolution）是指在试管中进行的“分子进化”，也即在实验室人工控制的条件下模拟和加速生物分子向特定目标进化的过程。其对象可以是蛋白质或多肽，也可以核酸和其他大分子，甚至是一些生物体中的小分子。它通过人工合成或借助于重组DNA技术，人为制造大量的变异体，然后按照特定的需要和目的，给予选择压力，或通过高通量筛选技术，将满足特定目的的分子筛选出来，从而实现试管中分子水平上的模拟进化。,5,定向进化是一个由构建突变体库，突变体表达，表达后筛选三个步骤组成的循环递进过程，需要：产生包含大量带有微量有利突变的突变体的文库;突变体应能在适当的微生物（如大肠杆菌或酵母菌）体内进行功能的表达;必须有一种灵敏的筛选方法，能反映出由一个氨基酸的置换而引起的预期性状的较小提高。,6,Directed（定点的）Random（随机的）Recombination（重组的）,LibrariesaregeneratedbymakingmutantDNAinthetesttube,9,变异库的产生和筛选,说明：colorometric比色法；fluorescent荧光法；chemiluminescent化学发光法；biotransformation生物转化；screen筛选,10,酶的定向进化,通过定点突变等基因改造技术，改变蛋白序列中的个别氨基酸残基，可以对酶的性质和其催化特性进行改造，产生符合特定需要的酶，这一蛋白质工程技术又称为分子进化的理性设计。这一技术使人们避开了对酶的构效关系的研究这一难题，并成功地用于酶的稳定性、底物特异性、立体选择性等酶的催化特性和酶的催化能力的改进。,11,定向进化不仅是一个酶分子改造的良好工具，也是探索和研究酶蛋白构效关系的良好工具。随着各种基因技术的应用和发展，产生包含大量带有微量有利突变的突变体的文库，已经不再是一个技术难题，当前的主要研究方向是更有效的突变技术和构建更简洁的突变体库的技术。,12,突变体的筛选技术仍然是主要技术瓶颈，当前除了要继续发展各种结合酶催化功能的高通量筛选技术，还要进一步完善各种与重组表达技术相结合的蛋白筛选技术和蛋白展示库技术。对一些无明显表型突变体的筛选需要更多的研究与重视。,13,人们已经利用定向进化方法成功实现对许多蛋白质分子的改造。如提高T4溶菌酶和酵母磷酸丙糖异构酶的热稳定性，改变枯草杆菌蛋白酶的Km和Kcat值，改变丝氨酸蛋白酶的最适pH值，提高酪氨酰-tRNA合成酶的活性，改善葡萄球菌核酸酶的特异性等。,14,定向进化技术包括：,定点突变（定点的）易错PCR（随机的）DNA重排（重组的）,15,一、定点突变,重组DNA技术不仅可以将外源基因导入受体菌构建新的工程菌，以表达目的产物，还可以用来对目的基因进行体外定向诱变，将目的基因按人们所希望的目标加以改造。基因体外定向诱变的基本方法是先克隆待诱变的目的DNA片段，并将它与载体重组，然后在体外对环状重组体进行定点突变，再将诱变后的DNA片段导入受体细胞使其表达目标产物。,16,17,Lipases,Esterasesthathydrolyzetriglyceridesatawater/oilboundaryUsesDegradationoffoodandfatDrugsforthetreatmentofdigestivedisordersanddiseasesofthepancreasDetergentadditivesOrganicSynthesisAcceptawiderangeofsubstratesStableinnon-aqueoussolventsEstersynthesisorhydrolysis(G0kcal/mol)说明：lipase脂肪酶，esterase酯酶，triglyceride三甘油酯，Degradation降解，Detergentadditives洗涤剂添加剂，hydrolysis水解,18,Lipases,KineticResolutionsofChiralAlcoholsandAcids“KazlauskasRules”,说明：KineticResolutions动力学拆分，Chiral手性的，L-menthol薄荷醇，Enalapril依那普利，(ACEinhibitor血管收缩转化酶抑制剂，Diltiazem地尔硫卓，(S)-naproxen萘普生，Flurbiprofen氟比洛芬,R=C20H42,C12H2642%Conversion,97%ee,45%Conversion,97%ee,IndustrialApplicationsL-mentholEnalapril(ACEinhibitor)Diltiazem(S)-naproxenFlurbiprofen,19,IncreasingEnantioselectivityRationalDesign,CandidaantarcticalipaseB(CALB)OxyanionHoleRemovestabilizinginteractionofthreonine40withsubstrateTwomutantsThr40Val,Thr40AlaSubstrate-assistedcatalysis,说明：Enantioselectivity对映选择性，OxyanionHole氧负离子孔洞，Candidaantarctica南极假丝酵母,Gincreasedby15-19kJ/molDecreasedkcat,20,IncreasingEnantioselectivityRationalDesign,SelectivityFactor,EHigherE,Greater%eeWild-typeCALB,E=1.6Thr40AlaCALB,E=9.8Thr40ValCALB,E=22,Magnusson,A.;Hult,K.;Holmquist,M.J.Am.Chem.Soc.2001,123,4354,E=,(kcat/Km)a,(kcat/Km)b,=,ln(1-U)(1+eeproduct),ln(1-U)(1-eeproduct),21,一、定点突变方法（具体）,基因体外定点突变的方法有：删除法插入法取代法不完全适配的低聚核苷酸介导法,22,（一）删除法,在目的基因中删除一个或若干个碱基序列，使基因发生重排而造成其性状的改变。基本操作方法：先克隆目的基因DNA片段，然后用酶切除DNA片段中的碱基序列，把保留的序列连接起来后，再导入受体细胞进行表达。,23,24,地衣芽孢杆菌-内酰胺酶具有脂蛋白的形式，它以肽链中的半胱氨酸27与膜类脂的甘油酯以硫醚键相连成为酶分泌过程中的中间产物。-内酰胺酶基因进行定向删除后，使基因产物缺失了5个氨基酸，包括半胱氨酸27，结果脂蛋白中间产物不再出现，但酶的催化活性和分泌性都不受影响。,25,（二）插入法,插入法即在目的基因中插入单个或多个核苷酸序列，使原基因序列发生改变进而改变基因产物。比较常用的插入方法是对待处理的DNA序列环状分子在适当的位点进行单处切割，使出现粘性位点，然后用Klenow片段处理样品，在dNTP和Mg2+的存在下，单链尾巴会被补链成为双链，原来的粘性末端成了平头端，环化后再导入受体细胞。,26,27,（三）取代法,取代法是将目的DNA中的某个碱基进行置换，使置换处编码的氨基酸发生改变。DNA中碱基的置换可以通过“点诱变”来实现。根据不同的诱变要求，点诱变可以有以下情况：特定的G:C变A:T错配取代,28,1特定的G:C变A:T,第一步：开创DNA单链区第二步：G:C变A:T,29,(1)开创DNA单链区,点诱变要在DNA单链上进行。首先在双链的目的DNA分子上某个限制酶切点附近开创出一小段单链区域。常用的方法有两种：一是先用溴化乙锭与DNA结合，再用限制酶切开一个裂口（gap），双链DNA中一条链仍保持完整。而后可用核酸酶ExoIII来开创出一个单链区域。另一种方法是利用DNA聚合酶沿着3-5的方向降解带有裂口的那条链。,30,（2）G:C变A:T,单链DNA上的胞嘧啶被酸式亚硫酸离子作用后反应脱氨基而变成尿嘧啶（CU），而双链部分的C则不发生变化。当把单链区域修补成双链时，A将与U配对，此时U相应于T,结果原来的G:C变成了A:T。,31,2错配取代,这种方法的原理是：当大肠杆菌DNA聚合酶或T4聚合酶对DNA分子的单链部分补链时，反应体系中如果只有四种核苷酸底物的三种，在正常情况下，新链的合成将会停止在所缺的那种核苷酸应该结合的位置之前。但在偶然情况下，DNA聚合酶会把所存在于反应体系中的某一种核苷酸错误地接在所缺的那种核苷酸应该结合的位置上，这样就可能造成取代作用。为了防止出现自动修正作用，可用-硫代三磷酸核苷作为底物，这种类似物不为酶所识别和纠正。,32,33,（四）不完全配对的低聚核苷酸介导法,以上的碱基取代都是在双链DNA分子的某个单链区域进行的。在双链DNA上要利用限制酶来切开一个单链裂口，这就意味着所发生的取代只能在限制酶切点的附近，这种空间的限制作用使上述方法具有一定的局限性。利用不完全配对的低聚核苷酸介导法可以克服上述局限性。,34,这种方法的具体操作是：在进行DNA处理前，先测定DNA的序列，根据诱变点附近的碱基排列顺序合成一段13个碱基左右的低聚核苷酸片段，低聚核苷酸与待诱变位点不配对但与诱变点两侧完全配对。将DNA分子克隆在噬菌体M13载体上变为单链后，与低聚核苷酸片段相混合，使该片段与DNA的相应部分发生“退火粘合”。补链后的双链DNA分子导入细胞后，经过第二轮复制，误配分子产生出野生型子代和变异型子代。,35,Oligonucleotide-directed,site-specificmutagenesis寡聚核苷酸介导的定点突变,36,(continued),37,Invitrosite-specificmutagenesis,50%WT,50%mutant,M13=singlestrandedbacteriophage,38,理论上，如果含突变的DNA链和正常的DNA链复制速率相同，应该有50%的克隆带突变基因。但是，由于许多技术上的原因，实际上一般只有1%5%的克隆带突变基因。显然，这样的效率还不尽如人意。此后，研究者又设计出很多方法以提高定点突变的频率，其中比较常用的Kunkel提出的一种配合该技术的诱变体产量富集法。,39,这种方法用具dut和ung基因缺陷的大肠杆菌制备M13载体。dut基因编码催化dUTP分解的dUTPase，该基因缺陷会使细胞中dUTP含量升高，导致复制时少量dUTP代替dTTP掺入DNA。ung基因编码尿嘧啶DNA糖基化酶，该基因缺失后，不能除去掺入DNA的dUTP。,40,因此，利用dutung-菌株制备的M13载体中，大约1%的T被U取代。以这样制备的M13(+)链为模板进行寡核苷酸介导的定点突变，然后将得到的双链DNA转化到dut+ung+菌株中，最初的含UU的模板会被降解，而突变链则因不含U被复制。这样，带有定点突变基因的噬菌体比例可显著提高。,41,EnzymethatremovesUfromU-containingDNA,ApyrimidinicDNAformedandwillnotreplicate,GetridofWTgenome:,MutantE.coliallowsUtopersistinDNA,42,二、易错PCR,用热稳定DNA聚合酶扩增目的DNA时，会以一定的频率发生碱基错配。这对高保真要求的DNA扩增来说当然是不利的，但这一现象恰好也提供了一种对特定基因进行随机褥变的可能方法。这种利用PCR过程中出现的碱基错配进行特定基因进行随机诱变的技术就称为易错PCR（error-pronePCR，简称EP-PCR）,43,易错PCR,44,在聚合酶链式反应的发展初期，人们就已经注意到它的易错本性（error-pronenature）但是，如果想将这种易错本性用于创造突变基因，即便是保真度最低的TaqDNA聚合酶，在常规的PCR反应条件下，其DNA复制的精确程度还是太高。,45,ErrorPronePCR,1.5PhosphateReactedwith3Hydroxyl,2.IfcofactorssuchasMn2+orconditionsarealtered,thenmistakesmade,46,为了降低PCR中DNA复制的精确度，最常用的方法是在TaqDNA聚合酶催化的PCR反应体系中加入一定量的Mn2+（替代天然的辅助因子Mg2+），并同时使反应体系中各种dNTP的比例失衡（通常是将其中的一种dNTP降至5%-10%）。由于TaqDNA聚合酶缺乏校对活性，其错配率会大大增加，通常可以达到每千碱基对1个突变左右。还可以加入dITP等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水平，采用这种方法可以将错配率提高到最高达每5个碱基对1个突变。错配率并不是越高越好，理想的突变频率为每个基因1.5-5个点突变。,47,ErrorpronePCRPCRhasanerrorrateof1/1000In10kB1to20mutationsKlenTaqMn2+(0.5mmol/L)UnequaldNTPconc.（5-10）,48,ErrorPronePCR,PCR,49,Error-PronePCR,50,从易错PCR的操作过程可以看到，易错PCR与传统诱变育种技术的最大差别在于，前者是基因水平上的随机诱变，而后者则是细胞水平上的随机诱变。而且易错PCR一般只产生点突变，因此它产生的突变体在多样性方面尚有一定缺陷。作为一种能够从单一基因产生丰富的随机突变体的技术，易错PCR得到了广泛的应用。,51,PracticalExample,buildupv.树立,增进,增大,堵塞，Carbamoyl氨基甲酰;hydantoin乙内酰脲，enantiomer对映体，opticallypure光学纯,52,Round1,1.EfficientgenerationofmanysolutionsErrorPronePCR.Colonypickingintomasterplates.Replicaplatingtogenerateassay-readycultures.2.TestingofmanysolutionsTested10,000colonies2setsof96wellplates:onewithLhydantoin,onewithDpHindicatorassayHPLCtoconfirmwithregrowncultures3.IdentificationofwinnersBacktomasterplateandregrewcultureforsequencing.TwowereslightlyL-selective(I95Lincommon)3anti-winners(e.g.D-selective)hadV154A,53,Round1-ctn.,54,Round2,1.EfficientgenerationofmanysolutionsErrorPronePCRon11DH7.ErrorPronePCRagainwithhighermutationrate2.TestingofmanysolutionsTested210,000colonies2setsof96wellplates:onewithLhydantoin,onewithD,asbefore3.Identificationofwinners22CG2hadvariationV180A:caused4increaseinactivity,sameenantioselectivityHighermutationrategavemoreactiveandmoreD-selectivemutants,55,Round3,1.EfficientgenerationofmanysolutionsSaturationmutagenesisatposition95toaccessall20aminoacids.2.TestingofmanysolutionsTested400Assayasusual3.IdentificationofwinnersQ2H4:20%D-selective(invertedfrom40%D)I95F,Q251A,V180A,56,Round3-ctn.,I95F,Q251A,V180A,57,Processtest,L-MetProduct,WT,Q2H4,58,三、DNA重排,DNA重排（DNAshuffling）技术是一种利用重组文库的体外定向进化技术，由Stemmer于1994年首先提出。DNA重排的特点是，它不仅能产生点突变，而且可以重组DNA片段。,59,DNAShuffling技术,DNAShuffling,DNA改组DNA洗牌DNA重排,1994年，Stemmer等，用DNAShuffling技术体外快速进化蛋白有性PCR法1997年，FranceArnold研究组将DNAShuffling技术做了改进交错延伸法,60,DNAShuffling与常规定向进化的比较,61,DNARecombination,UsuallyrequiressomesequencesimilarityCanintroducechimerascomposedofpartsof2genes,62,DNA重排的基本原理是首先将同源基因（单一基因的突变体或基因家族）切成随机DNA片段，然后进行PCR重聚。那些带有同源性和核苷酸序列差异的随机DNA片段，在每一轮PCR循环中互为引物和模板，经多次PCR循环后能迅速产生大量的重组DNA，从而创造出新基因。,63,64,RecombinationDNAshuffling,Wtgene,Fragmentation片段化，wtwildtype野生型,65,RecombinationDNAshuffling,Reassemble重聚，unprimed无引物的,66,DNA重排的原理和操作程序,DNA重排也称为有性PCR（sexualPCR），它与PCR技术密切相关，但与通常的PCR不同。在DNA重排中的PCR过程不需要加入引物。首先利用PCR或酶切方法获得目的基因片段，然后用化学或物理方法将其随机切成一定长度的小片段。这些小片段再通过重聚PCR延伸为具有全长的基因片段。最后将重排后的基因片段插入到载体中，并转移到宿主细胞中表达。,67,DNA重排的原理和操作程序,在重聚PCR过程中，当来自一种拷贝的小片段与另一种拷贝的小片段相互为引物时，即可发生模板的移位，这样可使亲本基因群中的突变发生多种组合，能导致各种各样的突变体。,68,69,DNAshuffling:invitrohomologousrecombinationandinvitroproteinevolution.Randommutagenesisbyerror-pronePCR(withexcessofonedNTP)togeneratediversityoftemplates(naturallyoccurringhomologousgenescanalsobeused).RandomfragmentationbyDNaseI.Reassemblyofthefragmentsbyaself-primingpolymerase(PCR-like)reaction:templateswitchingcausescrossoversinareasofsequencehomology.Selectionunderincreasingselectivepressures(antibiotics,pH,organicsolvent).,Invitro体外，homologousrecombination同源重组,70,凝胶电泳验证,71,凝胶电泳验证,72,ThreesuccessiveroundsofDNAshufflingproducedamutantwith16,000foldincreasedcefotaximeresistance.Backcrossingtwicewith40foldexcesswildtypeproducedamutantwith32,000foldincreasedcefotaximeresistance.Bothmutantshad9singlebasepairmutations.最小抑菌浓度(mic),Cefotaxime头孢噻肟氨噻肟头孢菌素;backcross回交,回交杂种,73,RecombinationFamilyshuffling,ExtentionoftechniquetohomologousgenesNeed60%similarity,Similarmutantsgeneratedbyerror-pronePCR,randomandsite-directedmutagenesis,.,.,.,.,.,.,.,Singlegeneshufflinglibraryofpointmutants,Familygeneshufflinglibraryofchimeras,Generatingchimeraswithcrossoversoflargeblocksofsequences,74,交错延伸法（staggeredextensionprocess，STEP）是一种简化并改进的DNA重排技术。它是由FranceArnold研究小组在1997年提出的。在一个PCR反应体系中以两个以上相关的DNA片段为模板进行PCR反应。,75,引物先在一个模板链上延伸，随之进行多轮变性、短暂复性（延伸）过程，在每一轮PCR循环中，那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复进行直到获得全长基因片段，重组的程度可以通过调整时间和温度来控制。此方法省去了将DNA酶切成片段这一步，因而简化了DNA重排方法。,76,交错延伸PCR突变法,77,磷脂酶热稳定催化活性的分子进化（JaeKwangSong等，2000）,DNAShuffling技术的应用,78,枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化（HuiminZhao等，1999）,进化后的枯草杆菌蛋白酶E,正面,反面,耐热p-硝基苯酯酶的分子进化(LoriGiver等，1998）,-葡糖苷酶耐热性的提高(MaraJesusArrizubieta等，2000）,Antigensexpressedbythe4dengueserotypes,NaturalEvolution,DNAShuffling,AncestralDengue,TetravalentDengueAg,MaxygensApproach:MolecularBreedingDirectedMolecularEvolution,MolecularBreedingDirectedMolecularEvolution,DEN-1virus,Wild-types1-4,Tetravalentclones,Vector,1-4mix,ELISAAntigen:,VaccineAg:,DEN-4virus,Wild-types1-4,Tetravalentclones,Vector,1-4mix,DEN-3virus,Wild-types1-4,Tetravalentclones,ELISAAntigen:,VaccineAg:,Vector,1-4mix,DEN-2virus,Wild-types1-4,Tetravalentclones,Vector,1-4mix,Themixtureof4wild-typeDNAvaccineconstructsgaveaninferiorresponse,DNAVaccineImmunizationofMiceandCross-ReactiveAntibodyInductionbyDengueChimeras,CollaborationwithDrs.Porter,HayesandRaviprakash,NMRC,Groupsreflectseparateimmunizations,Antigens:prM/E,Antigens:Eprotein,Cross-NeutralizingAntibodiesElicitedbyTetravalentDENAntigens(PRNT),IncreasingEnantioselectivityDirectedEvolution,PseudomonasaeruginosaLipase(PAL)epPCR1-2basesubstitutions/lipasegeneMaximumlibrarysize/generation55006generationsSaturationmutagenesiswasperformedat“hotspots”ScreeningMonitorabsorbanceat410nm,Reetz,M.etal.Chem.Biol.2000,7,709,87,IncreasingEnantioselectivityDirectedEvolution,S155Fident