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细胞凋亡中Caspase-3活性的检测关键词： 细胞凋亡 活性检测 执行分子 2012-09-27 18:04 来源：互联网 点击次数：5249 Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶poly（ADP-ribose）polymerase，PARP等的裂解。 方法：收集细胞PBS洗涤抽提细胞裂解液蛋白定量SDS-PAGE电泳硝酸纤维素膜或PVDF膜转移5%脱脂奶粉封闭，室温1.52h或4C过夜Caspase-3多抗或单抗室温反应12h或4C过夜TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，510min/次HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应12h TBS-T洗3次， 510min/次?ECL显影或NBT/BCIP显色。结果如下图 2 荧光分光光度计分析 原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?制备细胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽荧光底物）?37C反应1h?荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。结果如下图 3 流式细胞术分析 方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?加Ac-DEVD-AMC?37C反应1h?UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。结果： ht
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