1 2基因工程的基本操作程序课件

基因工程的基本操作程序,基因工程基本操作的四个步骤：,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,基因的结构（补充知识）,与RNA聚合酶结合位点,终止子,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。,转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,1、编码区：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质的序列。,2、非编码区：调控遗传信息表达的核苷酸序列(启动子、终止子），不编码蛋白质。,一、原核细胞的基因结构,二、真核细胞的基因结构,编码区,内含子,外显子,启动子,终止子,基因的结构（补充知识）,与RNA聚合酶结合位点,1、编码区,2、非编码区：调控遗传信息表达的核苷酸序列(启动子、终止子），不编码蛋白质。,一、目的基因的获取,1、目的基因的来源,2、获取目的基因的常用方法,从自然界已有的物种分离人工方法合成,从基因文库中直接获取如果需要大量的目的基因，需要对目的基因进行PCR技术扩增,（一）从基因文库中直接获取,按照外源DNA片段的来源：从特定组织提取的染色体基因组DNA-基因组DNA文库（总）mRNA反转录成的cDNA拷贝-cDNA文库（部分）,基因文库的目的,为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。,基因文库的分类,限制酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,1)基因组文库(Genomiclibrary),是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。,（一）从基因文库中直接获取,1.基因文库,（一）从基因文库中直接获取,1.基因文库,cDNA(complementaryDNA，互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库,2)cDNA文库(cDNAlibrary),基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,2.基因文库的构建方法,：直接分离法,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限制酶,受体细胞,产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基因,分离,(鸟枪法),（一）从基因文库中直接获取,多用于原核生物,逆转录法,目的基因的信使RNA,目的基因,化学合成法,肽链氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,逆转录,2.基因文库的构建方法,（一）从基因文库中直接获取,人工合成法（真核生物）,推测,推测,单链DNA,合成,（二）利用PCR扩增目的基因,1、过程,高温变性（解旋为单链）,低温退火（引物与单链互补结合）,适温延伸（在Taq酶的作用下合成与模板互补的DNA双链）,重复循环,1、过程,（二）利用PCR扩增目的基因,（二）利用PCR扩增目的基因,2、条件,已知基因的核苷酸序列、,四种脱氧核苷酸、,引物,TaqDNA聚合酶,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,4、结果,耐高温,3、方式：以指数方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,2n,适宜的温度和PH值,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,2、构建过程,复制原点目的基因启动子终止子标记基因等,1、基因表达载体的组成,想一想：其中有两个DNA片段连接形成的的产物有几种？,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意,1、导入植物细胞,农杆菌转化法:,表达载体导入农杆菌，再让农杆菌感染植物细胞,基因枪法花粉管通道法,显微注射法：将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中,2、导入动物细胞,3、导入微生物细胞,原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少,用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子,方法：,1、分子水平的检测：分子杂交技术,检测是否插入目的基因,检测是否转录出mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,2、还可以进行个体水平的鉴定,DNA分子杂交技术,抗体与蛋白质进行抗原抗体杂交，看是否有杂交带,依据其性状进行检测如：抗虫或抗病的接种实验,归纳:基因工程的基本操作程序,获取目的基因从基因文库利用PCR技术构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法、基因枪法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译、个体水平的检测,1有关基因工程的叙述正确的是()A限制酶只在获取目的基因时才用B重组质粒的形成是在细胞内完成的C质粒都可以作为运载体D蛋白质的氨基酸排列顺序可以为合成目的基因提供线索,练习：,2科学家已经能够通过基因工程的方法，能使番茄果肉细胞中含有人奶蛋白。以下有关该基因工程的叙述错误的是（）A.采用反转录的方法得到的目的基因有启动子、终止子B.用同种限制酶处理质粒和含目的基因的DNA，可产生相同的黏性末端而形成重组DNA分子C.番茄的叶肉细胞可作为受体细胞D.启动子对于目的基因在番茄的叶肉细胞中的表达是不可缺少的,B复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸DPCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高,3多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95下使模板DNA变性、解链55下复性（引物与DNA模板链结合）72下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是,A变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现,3、假设以大肠杆菌质粒作为运载体，并以同一种限制性内切酶切割运载体与目的基因，将切割后的运载体与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶。连接产物至少有_种DNA分子，它们分