分子荧光光谱分析PPT.ppt

光致发光（Photoluminescence）:荧光和磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时的发光现象.荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。,分子的多重态单重态一个所有电子自旋都配对的分子的电子状态。大多数有机物分子的基态是单重态。当基态一对电子中的一个被激发到较高能级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。三重态有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态能量较激发单重态低。,一、分子退激发的过程激发态分子回基态的途径很多，速度最快的途径占优势。1、振动驰豫1）分子吸收光子后，可能被激发到激发态的各个振动能级2）通过碰撞（非辐射跃迁）到达同一激发态的最低振动能级需时间10-1310-11sec，效率较高2、荧光发射,分子从单重激发态的最低振动能级发射光子回到基态荧光发射。荧光光谱的波长比吸收光的波长大（长），这种现象叫作红移或斯托克斯位移。3、内部转换1）分子内过程，热退激2）两个激发态重叠的能级发生内转换，因此吸收1、2两种波长的光后，都产生2的荧光。4、外转换激发态分子与溶剂或其它溶质间相互作用和能量转换。,5、能系间交叉跃迁电子自旋被反转，使分子的多重性发生变化6、磷光从三重态最低振动能级回到基态，放出磷光。二、影响荧光强度的因素1、荧光效率（荧光量子产率）物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（）表示：,f与退激发过程的速率常数k有关,凡是使荧光速率常数kf增大而使其他退激发过程（能系间交叉、外转换、内转换的速率常数减小的因素都可使荧光增强。,Kf、Ki与分子结构有关，Kec、Kic与分子所处的环境有关,高荧光分子f1，无荧光分子f02、影响荧光强度的因素1）荧光与分子结构的关系a、能吸收紫外可见光，有共轭双键，分子呈刚性、平面、多环结构，而且共轭平面越大、电子共轭度越大，f越高。b、取代基的影响给电子基团使f增强，如-NH2、-OH与电子体系相互作用小的取代基对荧光影响小,高原子序数的原子引入电子体系，使荧光减弱吸电子基团，如：-COOH、NO2、N=O2、卤素使荧光熄灭。刚性平面结构有利于荧光，因为刚性结构可以减少分子振动，减少能系交叉和碰撞退激。2）温度和溶剂效应温度升高，f下降溶液黏度下降，f下降不能使用含有重原子的溶剂,溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧光波长红移；若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变。,3）pH值的影响荧光物质的电离与非电离形式的f有差别，带有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH关；4）溶解氧的影响溶解氧的存在使f下降,第二节荧光分光光度计一、基本构造1、光源强度较高的氙灯或氙汞灯，要求有稳定的供电源。2、单色器两个，互成直角3、样品池四通杯4、检测器光电倍增管,二、仪器光路,光源,激发单色器,样品池,发射单色器,检测器,第三节荧光光谱法的基本参数及测量一、荧光强度根据朗伯-比尔定律Ia=I0-I=I0(1-10-bc)则If=fI0（1-10-kbc)=I0(1-e-2.303k=bc)对于稀溶液，kbc=AA0.05If=2.303fI0kbc当I0一定并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比If=KCK=2.303I0kb),Cmax0.05/kb当C超过Cmax时，IfC偏离线性溶液浓度太大，荧光分子之间及荧光分子与溶剂分子之间碰撞，发生非辐射跃迁，使荧光强度下降。荧光自熄灭：C增大到一定程度，就会发生荧光自熄灭现象荧光自吸收：荧光荧光波长与激发光波长重叠时，荧光被吸收,二、激发光谱与发射光谱激发光谱:固定发射波长(EM),一般在最大发射位置做IfEX的光谱，既不同波长激发光所产生荧光的相对效率。发射光谱:固定激发波长(Ex),一般在最大吸收位置做IfEM的光谱，既最大吸收波长下产生荧光的相对强度。目的:找到EXmax和EMmax,三、荧光分析法直接荧光法：样品本身发荧光，直接测定其荧光强度，按吸收定律计算样品浓度。间接荧光法：样品本身不发荧光，通过探测剂（强荧光物质）间接测定。探测剂称为荧光探针样品浓度的定量计算采用标准曲线法,四、荧光分析法的应用,无机物分析无机离子中除少数例外一般不发荧光.但很多无机离子能与一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量测定.生物化学及生理医学方面的应用荧光法对于生物中许多重要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用于生物化学分析,生理医学