凝胶电泳2.doc

论文题目：凝胶电泳专业： 化学年级： 10级 学号： 10101550203姓名： 马慧摘要凝胶电泳（Gel electrophoresis）或称胶体电泳，也可称为扁平式电泳法，是一大类技术，被科学工作者用于分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子。它是以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法。凝胶电泳通常用于分析用途，但也可以作为制备技术，在采用某些方法，如质谱、聚合酶链式反应、克隆、DNA测序或者免疫印迹检测之前，进行部分提纯分子。通过学习，了解凝胶电泳的类别、原理、特点及其应用范围。关键词：制备，类别，定义，原理，特点，应用范围正文一、凝胶制备1、设备与试剂：琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可制备低浓度琼脂糖凝胶，而且制胶与加样都比较方便，故应用比较广泛。核酸分离一般用连续缓冲体系，常用的有TBE（0.08mol/LTrisHCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/LEDTA）和THE（0.04mol/LTrisHCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸钠，0.0018mol/LEDTA）。2、凝胶制备：用上述缓冲液配制0.5-0.8琼脂糖凝胶溶液，沸水浴或微波炉加热使之融化，冷至55时加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5g/ml，然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中，厚度依样品浓度而定。注胶时，梳齿下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脱凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下1mm处。3、样品制备与加样：溶解于TBE或THE内的样品应含指示染料（0.025溴酚蓝或桔黄橙）、蔗糖（10-15）或甘油（5-10），也可使用2.5Fico增加比重，使样品集中，每齿孔可加样5-10g二、电泳方法将待测分子放进凝胶上的井并导入适当的电流，分子就会以不同的速率在有孔隙的胶体中移动；如果分子带负电多就会往氧化极，带正电多就往还原极移动（注意到胶凝电泳操作原理相似于电解电池，氧化极带正电而还原极带负电）。以核酸(DNA或RNA)的例子里，待测分子从负电极到正电极的移动方向是因为核酸本身在凝胶上携带糖-磷酸盐而造成负电。双股DNA片段自然的形成长杆状，所以核酸片段在凝胶内的移动和他们的旋转半径有关。简单的说，就是和分子大小相关。单股DNA或RNA倾向于折叠成复杂形状的分子，根据它们的三级结构，以复杂的方式在凝胶内移动。因此，像是氢氧化钠或甲酰胺这类可以破坏氢键的化学物，就用来把DNA或RNA从三级结构变性，再度形成长杆状。在跑完电泳，最小的分子几乎到达氧化极之后，可以对凝胶里的分子染色，这样才能看到分子。可以用溴化乙锭，银或考马斯亮蓝染色。也可以用其他方法看到凝胶里分离后的混合物组成。如果分析物的分子在紫外线下会发光，就可以在紫外线下拍出凝胶的照片。如果要分离的分子有放射性原子，凝胶可以用同位素示踪剂记录，记录方法同上面所述。如果一开始有很多个混合物一个接一个注入相邻的孔里，跑出来的结果会是一条一条平行的行。根据不同分子的数量，每一行都有一条或一条以上明显的亮带，表示原本混合物分离出来的组成，每个亮带代表一个组成，组成物分离不完全就会跑出重叠的亮带，或者难以辨别的污点就表示许多组成物没有分解。三、凝胶电泳的种类及其各自的定义，原理，影响因素和应用。凝胶电泳被广泛用于分子生物学、遗传学和生物化学。1、琼脂糖凝胶电泳定义：用琼脂糖凝胶作支持物的电泳法。借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，核酸片段因其分子量或分子形状不同，电泳移动速度有差异而分离。是基因操作中常用的重要方法。原理：琼脂糖凝胶具有网络结构，琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。特点：琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占 98 % 99 %），近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸收吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；琼脂糖呈透明状，无紫外吸收，电泳后的样品可直接用紫外检测；电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定；操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。 应用范围和应用实例：由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于分离纯化超螺旋DNA，检测核酸。2、聚丙烯酰胺凝胶电泳定义：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）。特点：非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。应用范围和应用实例：分离不同荷电量、不同分子量的物质，而使其固定在凝胶中而不是丢失在溶液中。可以调节凝胶浓度而调节网孔大小，以适应你的目标物质的分子量。一般可用于蛋白质、核酸等两性大分子物质分离分析。3、毛细管电泳 定义：以毛细管为分离通道、高压电场为驱动力的电泳分离分析法。包括毛细管自由流动电泳、毛细管区带电泳等。原理：毛细管电泳所用的设备是石英毛细管柱，在pH值3的情况下，其内表面带负电，与缓冲液接触时形成双电层，在高压电场作用下，形成双电层一侧的缓冲液由于带正电而向负极方向移动，从而形成电渗流。同时，在缓冲溶液中，带电粒子在电场作用下，以各自不同速度向其所带电荷极性相反方向移动，形成电泳。特点; 容积小（一根100 cm75 m 管子的容积仅4.4 L）；侧面/截面积比大，因而散热快、可承受高电场（100-1000 V/cm）；可使用自由溶液、凝胶等为支持介质；在溶液介质下能产生平面形状的电渗流。应用范围和应用实例：测定药物与蛋白结合常数，如区带毛细管电泳法是利用蛋白质与药物的结合产物同游离的药物或蛋白的淌度差异来研究相互作用的。也可以和质谱联用，对一些紫外吸收较弱的化合物的检测。4、明胶酶谱法定义：将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置齿孔中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min/次，做2次或15min/次，4次。静置于齿孔中是不妥的。）时，由于SDS被齿孔结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。 特点：明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液 配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。 应用范围和应用实例：分离鉴定化合物。如分离二价金属离子。5、变性梯度胶凝电泳（DGGE） 定义：在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。原理：一个特定的DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。一个几百个碱基对的DNA 片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区域浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当浓度度再升高依次达到各其他解链区域浓度时，这些区域也依次发生解链。直到变性剂浓度达到最高的解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA 完全解链。特点：几乎可以检出所有突变；对突变分子无损害；无须标记；电泳前只需一步操作；可以配置外置式冷却器，温度能在0和70之间控制，可用于TGGE（温度梯度凝胶电泳）分析。DGGE实验及很多其他实验，温度是一个关键因素。使用缓冲液系统，精确控制温度变化保持在0.1内。应用范围和应用实例：广泛应用于各微生物生态系统的研究；能够快速同时对比分析大量的样品；可以跟踪监测细菌测富集和分离；可用于未经扩增的基因组DNA检测；可检测出像甲基化的DNA修饰。结论 凝胶电泳是一大类技术，它分为好几种类型，每种电泳法都有其原理、特点和应用范围。要想完全了解凝胶电泳，需要分类学习，对比总结其特点和差异。通过搜集资料，查阅文献，我学到了很多关于凝胶电泳的知识。也知道了凝胶电泳的应用范围很广。可以应用在生物学、遗传学、生物化学方面。即可以检测物质，也可以分离提纯。凝胶电泳是一项非常有使用价值的技术。我