流式细胞术分析及应用

1,流式细胞术分析及应用,2,流式细胞术的原理流式细胞术的应用流式细胞术的数据处理流式细胞术的样品制备,主要内容,流式细胞仪(FlowCytometer):是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术(FlowCytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。,3,一、流式细胞术的原理,现代流式细胞仪包括,液流系统聚焦细胞以供检测光学系统激发和收集光信号电子系统将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析,4,液流系统,液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处,5,SampleFlowinOpticalCuvette,6,Sample,LaminarFlow,LowSampleFlowRate12mL/min,Sheath,Sheath,Sample,LaminarFlow,Sheath,Sheath,OpticalCuvette,HighSampleFlowRate60mL/min,样品和鞘液流,7,8,InjectorTip,Fluorescence,signals,Focusedlaser,beam,Sheathfluid,流式细胞仪的光学系统,激光(Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照。激光波长:台式机为固定波长488nm,635nm，大型机波长谱线宽包括325，457.9，488,514.5，520.8，530.9，568.3，633，647nm光收集系统是由若干组透镜，滤波片，小孔组成，将产生的光信号引导至检测器。,9,流式细胞仪的光信号,散射光信号荧光信号,10,11,1.散射光信号,前向角散射光（FSC,ForwardScatter）入射激光的同向散射光信号细胞相对大小及其表面积。侧向角散射（SSC,SideScatter）入射激光90角的散射光信号细胞粒度及细胞内相对复杂性。,前向角散射光FSC,12,侧向角散射光SSC,13,散射光,散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异-通常使用“散点图”来看散射光信号-散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据,14,散点图DotPlot,15,lysedwholeblood,2.荧光信号,荧光素吸收激光能量荧光素将吸收能量释放，转换为振动能和热能释放较入射光波长更长的光量子荧光素与特异抗体结合荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强,16,Fluorochromespecification,17,18,Compensation,二、流式细胞术的应用,细胞表型分析胞内蛋白的检测细胞周期分析细胞因子测定分选细胞内钙离子测量,19,1.细胞表型分析,20,21,2.胞内蛋白的检测,22,3.细胞周期的检测,23,CFSE（羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂）,24,4.细胞凋亡的检测,25,26,1、荧光信号的面积：对荧光光通量进行积分2、DNA指数(DI)：相对DNA含量=样品G0/G1细胞DNA含量平均数标准二倍体DNA量的平均数3、异倍体：非二倍体，包括近二倍体、四倍体、多倍体、非整倍体,凋亡细胞的特点,在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏凋亡细胞的FSC降低，SSC增加。细胞坏死时，细胞肿胀，FSC增大，SSC也增大,27,AnnexinVAssay,28,29,AnnexinV/PI双染活细胞为（AnnexinV-/PI-）坏死细胞为（AnnexinV+/PI+）凋亡细胞（AnnexinV+/PI-）,AnnexinVAssay-能够区分死亡与凋亡,30,31,5、细胞因子测定,+,+,Antigen(cytokines),FluorescenceDetectorantibody,Capturebeads,Captureantibody,Beads,32,BeadsProvideaFlexiblePlatform,Multiplesizes,Beadsprovideanexpandableassayplatformforusewithaflowcytometer,Differentintensities,Differentcolorswithdifferentintensities,33,MultiplexedBeads,Shadesofacolor,Antibodycoupledbeads,emittingatdistinctFL3intensities,Variousanalytes,AntibodycoupledPElabel,emittingatFL2intensityproportionaltoanalyteconc.,34,Example6-beadassay,CaptureBeads,LysateorSupernatantSample,DetectorAntibodies,35,CBAStandardcurves,6、细胞分选,36,37,细胞分选,38,三、流式细胞数的数据处理,39,40,41,42,43,44,45,compensation,46,分析软件,47,常用软件FlowJo,48,Gating,49,50,51,52,四、流式细胞术的样品制备,单细胞悬液，避免任何细胞沉积被检细胞或颗粒大小0.240um样品中至少20000个细胞，浓度105-106个/毫升,53,抗体的选择,首选直接标记抗体荧光分子PE最强，适用于弱表达抗原FITC最便宜，适用于强表达抗原间接标记：效果有时不太好,54,实验对照的设计,空白对照：阴性对照：常用同型抗体对照单色分析：设同型抗体对照多色分析：同型对照，单阳性对照（单标）同型对照(Isotype)：使用与抗体相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于检测由于抗体非特异性结合而产生的背景染色。阳性对照：检测阴性时,55,表面分子检测样品制备,将细胞样本制成单细胞悬液，注意悬液内不能有粘集，团块，尽量避免多的细胞碎片。调整细胞浓度为5104-1105个，用PBS洗两次，用100ulPBS重悬细胞。加入适量Fc受体阻断剂（与抗体匹配的动物的血清或IgG），4避光放置30分钟。加入适量的特异性表面标记荧光抗体或独特型对照抗体，4避光放置30分钟。用PBS洗两遍，用200ul固定液重悬细胞，上机检测。,56,胞内分子检测的样品制备,收集细胞，调至1106细胞/毫升。4%固定液重悬细胞，常温或4避光放置30分钟