免疫原和抗血清的制备概要.ppt

免疫原和抗血清的制备,第一节免疫原的制备,免疫原是能够引起机体产生抗体，并能与之发生反应的物质一、颗粒性抗原的制备：1.颗粒抗原指细胞抗原或细菌抗原。2.细菌抗原：H抗原有动力的菌株O抗原1002-2.5h为了破坏H抗原，获得O抗原Vi抗原3.虫卵、细胞膜颗粒抗原呈乳浊状，多用V内免疫，较少用佐剂作皮内注射,二、可溶性抗原的制备：,组织和细胞粗抗原的制备：1.组织和细胞混合抗原的制备：组织匀浆制备：标本要求：新鲜或低温（-40）保存的去除表面包膜或结缔组织或一些大血管，脏器应进行灌注，除去血管内残留血液制备处理好组织0.05NaN3生理盐水洗净剪成小块粉碎高速组织捣碎机法2000-3000rpm离心10min研磨法：玻璃匀浆器,乳钵研磨上清10000-20000rpm20-30min高速离心,2.细胞抗原的制备：,细胞抗原细胞膜蛋白抗原细胞浆抗原细胞核及核膜抗原粉碎：（1）反复冻融法（2）冷热交替法：适合细菌，病毒蛋白质及核酸（3）超声破碎法：适合于微生物和组织细胞细菌，尤其真菌厚膜孢子难破坏（4）自溶法：利用组织和微生物的自身酶系需一定PH和温度动物组织cell0-4微生物室温（5）溶菌酶法：一定PH（PH8.0），溶菌酶可专一破坏菌胞。蜗牛酶，纤维素酶消化细菌和组织cell（6）表面活性剂处理法,蛋白质抗原的制备和纯化：,可溶性抗原绝大部分为蛋白质1.超速离心和梯度密度离心法：用来分离亚细胞部分及大分子蛋白质1）差速离心：高低速交替进行。将大分子物质分离2）梯度密度离心：区带分离法，通过梯度密度来维持重力的稳定性，通常分离的悬液中的颗粒比液体重，要使之上浮，必须加入第三种成份，其密度连续或不连续升高，即所谓梯度3）第三种成份多用甘油、蔗糖氯化色，氯化铷适合于少部分大分子抗原，对于大量的中、小分子量的蛋白质抗原不适用此法,2.选择性沉淀法：,用沉淀剂或改变某些条件促使抗原成分沉淀1）核酸除去法：（1）提取沉淀剂：（2）核糖核酸酶降解法：用DNA或RNA酶与提取液作用30-60min（4），即可除去核酸2）盐析沉淀法：（1）抗原的粗筛33-50饱和度的硫酸铵（2）提取丙种球蛋白主要为IgG33-40饱和度的硫酸铵（3）抗原的浓缩3）有机溶剂沉淀法：有机溶剂多为酒精和丙酮4）水溶性非离子型聚合物沉淀法：PEG+蛋白质颗粒沉淀、复合物、蛋白质发生水的重分配分子量2000-6000PEG可用于沉淀蛋白PEG浓度不同可沉淀不同pro3-4沉淀免疫复合物6-7沉淀IgM8-12沉淀IgG12-15%沉淀其他球蛋白25沉淀白蛋白,3.凝胶过滤和离子交换层析：,1）分析筛层析又名凝胶过滤，将Ag分成大、中、小三种大分子较快出来，小分子因被阻留，出来较慢。根据分子量不同2）离子交换层析：离用带离子基因的纤维素流动相逐步增加离子强度，蛋白质按电荷不同或量的差异分组常用DEAE纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）根据pro携带电荷不同（溶液中等电点不同）常用于分离IgM因为IgM分子量大凝胶过滤洗脱曲线,4.亲和层析：,利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间的具有的专一性亲和力而设计的层析技术。eg：Ag和Ab，酶和酶的抑制剂，酶蛋白和辅酶，激素和激素受体等其之间有特殊亲和力，可紧密结合成复合物.1）亲和层析支持物的选择：常用：琼脂糖珠（Sepharose2B、4B、6B）,2）配体的选择：3）抗原或抗体与支持物的结合：步骤：（1）活化支持物上的功能基因溴化氛PH11与支持物上的羟基形成氨基形成氨基甲酸酯基因（2）交联（联接）（3）清洗：除去未结合的pro（4）亲和层析条件的选择：原理：一定条件下，Ag和Ab能可逆性地结合成复合物，当条件改变（如稀酸、稀碱、浓盐、加温等）时又可将抗原抗体解离。如果将抗原或抗体固定在不溶性的载体上能从液相中专一性分出抗体或抗原。根据这一原理，将可溶性抗原（或抗体）用化学方法偶联到不溶性载体上，当将相应的抗血清（或抗原）按层析方法加入柱中，抗血清中的相应的抗体与抗原特异性结合。其他蛋白成分随洗脱液流出。再改变缓冲液的PH值和离子强度，则可以使抗体和偶联在载体上的Ag解离（加入解脱剂），经洗脱，从而得到纯化的Ab。,2）配体的选择：,抗原或抗体与支持物的结合：步骤：（1）活化支持物上的功能基团溴化氰PH11与支持物上的羟基形成氨基甲酸酯基团（2）交联（联接）（3）清洗：除去未结合的pro（4）亲和层析条件的选择：原理：在一定条件下，Ag和Ab能可逆性地结合成复合物，当条件改变（如稀酸、稀碱、浓盐、加温等）时又可将抗原抗体解离。如果将抗原或抗体固定在不溶性的载体上就能从液相中专一性地分出抗体或抗原。根据这一原理，将可溶性抗原（或抗体）用化学方法偶联到不溶性载体上，当将相应的抗血清（或抗原）按层析方法加入柱中，抗血清中的相应的抗体与抗原特异性结合。其他蛋白成分随洗脱液流出。再改变缓冲液的PH值和离子强度，则可以使抗体和偶联在载体上的Ag解离（加入解脱剂），经洗脱，从而得到纯化的Ab。,以免疫亲和层析为例（三）免疫球蛋白片段的制备：,1）温和分离亚单位：（1）改变PH值PH3或10，Ig亚单位自动解离（2）利用强度性剂适合载脂蛋白Ag和胶原肽的提取2）二硫键的解离：适合于将轻、重链分开3）溴化氰裂解法：与蛋白质中的甲硫氨酸侧链的硫醚基起反应，生成溴化亚氨内酯4）酶法裂解：木瓜酶将IgG分解为Fc和Fab（2）三个片段胃蛋白酶IgG分解为（Fab）2和几个小肽段胰蛋白酶IgG切成不规则肽链应用：木瓜酶切断，得Fc段，制备抗重链血清胃蛋白酶切取，得F（ab）2，用于诊断（用Ab鉴别Ag）,（四）纯化抗原的鉴定：,1.含量鉴定：生化方法酚试剂法双缩脲法可见光吸收法紫外吸收法Ag宝贵，少2纯度的鉴定：醋酸纤维薄膜电泳法经典常用聚丙烯酰胺凝胶电泳法免疫电泳法免疫双扩散法ELISA或RIA（放免）不纯，也可能是同一物质的聚合体或降解物较纯，也不能排除在这条带中有其他成分所以单一方法，可信度差。因而几种方法联用较可靠,三、半抗原免疫原的制备,半抗原：只有反应原性，没有免疫原性的小分子物质半抗原+载体大分子物质-Ab人工抗原结合方法物理法：利用电荷和微孔化学法（一）载体的选择：1.蛋白质：常用牛血清白蛋白2.多肽类聚合物：常用多聚赖aa3.大分子的聚合物和某些颗粒：加入福氏佐剂可产生良好Ab（二）联接的方法：三个基本条件：1.碳化二亚胺法;2.二醛法：3.混合酸酐法（氯甲酸异丁酯法）三）无羧基和氨基半抗原衍生物的制备：1.琥珀酸酐法2.O-（羧甲基）羟胺法3.一氯醋酸钠法，适用于带酚基的半抗原4.重氮化的对氨基苯甲酸法：适于带酚基的半抗原,四.佐剂：,（一）使用佐剂的目的为提高免疫原性佐剂本身可有或无免疫原性（二）机理：1.可直接或参与cell免疫反应2.佐剂与Ag混合，可以使Ag在局部组织的存留时间长，延长Ag的局部吸收。可持续刺激机体，产生高滴度Ab3.佐剂可增加Ag表面积，并改变Ag的活性基因构型，从而增加Ag的免疫原性。,常用的佐剂和制备方法：,1.应用最多的为福氏佐剂不完全：石蜡油+羊毛脂完全：石蜡油+羊毛脂+卡介苗2.乳剂的制备：乳剂：Ag和佐剂的混合物Ag与佐剂比例为1：1，注射前要充分乳化乳化方法研磨法搅拌混合法旋涡混合,抗体的制备,多克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,第二节抗血清的制备,免疫原+佐剂刺激动物机体获得抗血清一.动物的选择1.种属差异越远越好，太近不易产生良好的抗体，甚至不产生2.抗血清量的要求：量大，选大动物量少，选小动物3.抗血清的要求：R型（兔型）H型（马型）4.抗原的选择：蛋白质Ag大部分动物皆适合，常用家兔、山羊IgE对绵羊，胰岛素对家兔，酶对山羊免疫时不产生Ab5.甾体激素多用兔，酶多用豚鼠6.对动物个体的要求：雄性稚龄、健康、正常、无感染,二、免疫前准备,1.正常饲养：3d，观察是否健康、正常、无感染2.取阴性血清：耳静脉取血,二、免疫剂量、时间和途径选择原则：,1.剂量：大动物0.5-1mg/只小动物0.1-0.6mg/只1）免疫剂量不要过大，Ag过量，易产生免疫抑制2）第一次免疫剂量要小，多次免疫后可加大剂量3）选择合适的免疫剂量，要根据Ag性强弱，分子量大小，动物大小，免疫时间而定。2.时间：1）间隔时间短，易产生免疫抑制一般第1、2次间要有10-20d，2次以后7-10d2）半抗原间隔时间长3.途径：多点注射，（足掌、腋窝L结周围，背部两侧，颌下，耳后皮内或皮下注射）Ag宝贵，采取微量注射法,免疫程序：,1.背部皮下多点注射2.淋巴结内注射,试血,1.根据免疫程序末次免疫，从耳静脉取血分离血清2.琼脂双扩散测效价,三.动物采血法：,抗血清鉴定采血前，禁食动物24h，防止血脂过高末次免疫后，5-7d之内采血。否则抗血清效价1.颈动脉放血法：适于兔、羊2.心脏采血法：适于小动物3.静脉多次采血清免：耳中央V100ML羊：颈V1500-2000ML小鼠：断尾或摘除眼球2ML抗血清分离，灭活5630min,第三节抗血清的鉴定和保存,一、抗血清的鉴定：免疫成功，Ab较纯，含有杂Ab免疫不成功1.特异性鉴定：免疫双扩散法2.效价的鉴定：免疫双扩散法Ab稀释法：不稀释1/21/41/81/161/321/64Ag1/32作为Ag效价3.AgAb的亲和力的鉴定Ag+AbAgAbK值109-1011L/mol之间K值大，AgAb结合力大K值小，AgAb结合力小,二、抗血清其他鉴定方法：,三、抗血清的保存：1.4无菌处理，防腐液体状态3-6月2.-20-40度冰冻保存5年小包装3.干燥冰冻5-10年,第四节抗血清中抗体的纯化,目的：除去杂Ab1.Ab特异性的纯化除去杂Ab1）吸附剂法2）亲和层析2.特异性IgG抗体的制备：1）盐析法粗提V球蛋白不同饱和度的（NH4）2SO4或Na2SO42）离子交换层析法提取IgG：常用DEAE纤维素IgG带正电荷，其他pro带负电荷3）亲和层析法提取特异性IgG4）酶解法制备F（ab）2片段,第五节单克隆抗体及基因工程抗体,一、单克隆抗体：1、淋巴细胞杂交瘤技术2、单克隆抗体3、单克隆与多克隆抗体比较4、用途二、基因工程抗体,一、单克隆抗体,1、淋巴细胞杂交瘤技术(kohlermilstein)淋巴细胞杂交瘤技术：75年才创立的技术，将在体外不能长期生存的免疫细胞与在体外能迅速增殖的骨髓瘤细胞在聚乙二醇的作用下融合产生杂交瘤细胞，所得杂交瘤细胞继承了两种细胞的能力，即保存了瘤细胞在体外迅速增殖传代的能力，又继承了免疫细胞合成与分化的能力，淋巴细胞主要T细胞、B细胞(T细胞与胸腺瘤细胞融合，可产生分泌淋巴因子的T细胞杂交瘤)B细胞与瘤细胞融合，产生能分泌特异抗体的B细胞杂交瘤。,2、单克隆抗体：,通过淋巴细胞杂交瘤技术，把产生特定抗体的B细胞与能无限生长的骨髓瘤的细胞融合，形成的B细胞杂交瘤，由这克隆化B的杂交瘤所产生的抗体。纯度高，专一性强，重复性好，且能持续在动物体外或体内产生固体性抗体。,3、单、多克隆抗体比较：,多克隆抗体：是由多个淋巴细胞克隆产生的(抗原分子量大，表面决定簇多产生不抗体)是高度异质性，特异性低，纯度差，反应不够灵敏，限制免疫学血清学的发展，影响诊断准确性和治疗效果。单克隆抗体：特异性强，体外产生，质地均一，反应灵敏，工业化生产任何多肽蛋白质特别是半抗原均可用淋巴细胞杂交瘤技术来制备单克隆抗体。,4、单克隆抗体的应用：,单克隆抗体技术被誉为免疫学的一次革命，是20世纪后20年内最为重要的生物高技术之一。1984年获诺贝尔医学与生理学奖。从医、农、食品等给人带来新的希望。多克隆抗体特异性低，纯度差，反应不够灵敏，影响诊断的准确性，及治疗效果，以及实验技术的提高，还出现血清病，过敏性休克，含量不一，无法标准化。单克隆抗体特异性高，滴度高，质地均一，反应灵敏，可标准化等优点，可工业化大规模生产，单克隆产品诊断试剂投资少，收效快，产值高。任何多肽与蛋白如病毒、细菌、寄生虫，正常细胞及恶化细胞，各种因子受体与介质、激素、酶类和血液成份，食物品与环境的有害物，甚至一段氨基酸、核苷酸DNAorRNA顺序化合物半抗原，都可通过B细胞杂交瘤技术，制备出相应单克隆抗体。,开发癌瘤、病毒性疾病、化脓性疾病、自身免疫疾病和移植排斥反应的单抗新药，广泛应用基础研究、疾病诊断、环境、食品监测，治疗、预防提纯蛋白，优生优育等，主要应用以下几方面：（1）疾病诊断（2）体内显象定位检查（3）体内治疗和导向治疗（4）食品环境监测（5）提纯蛋白与基因工程产品，用于人、动、植物各学科的分子生物学研究,5.单克隆抗体的制备,单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb）抗原决定簇：Ag上特异的化学基因称Ag决定簇。当Ag免疫动物时，Ag的每个抗原决定簇可分别刺激相应Bcell，因为每个Bcell表面的Ag受体只针对一个Ag决定簇，并产生针对该Ag决定簇的Ab。一个Bcell只识别一个Ag决定簇，并产生该Ag决定簇的Ab，称为单克隆Ab。这种Ab是均一的，且是单一特异性的。1种Ag可有多个抗原决定簇,第一节B淋巴细胞杂交瘤技术的原理,B淋巴细胞杂交瘤：用人工方法使Ab产生cell与骨髓瘤cell融合而成，产生的一类特殊cell。Ab产生cell来源于小鼠脾cell（B细胞）骨髓瘤cell来源于同系小鼠。可大量体外增殖，长期培养杂交瘤cell兼有两种亲本cell特性，既能分泌Ab，又能大量增殖,一、Bcell杂交瘤技术的原理：二、小鼠骨髓瘤cell的筛选：三、细胞融合剂：PEG多选分子量1000-2000PEG的作用基理：PEG可改变cell膜脂类分子排布，使cell膜易脂类分子排布，使cell膜易被打开，最终引起cell融合,HAT培养基的选择作用：,HAT次黄嘌呤（H）核苷酸前体，使cell通过替代途径合成DNA氨基蝶呤（A）叶酸拮抗物，阻断cell合成DNA的主要途径胸腺嘧啶核苷（T）使cell通过替代途径合成DNA,cell合成DNA有两种途径：,主要途径：糖、aa、合成核苷酸合成DNA需叶酸参与氨基蝶呤（A）可阻替代途径：次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶核苷（T）HGPRTTK催化小鼠骨髓瘤cell都缺乏HGPRT，在HAT培养基中，不能完成完整DNA合成过程易死亡杂交瘤cell可利用脾C的HGPRT，通过替代途径合成DNA,杂交瘤cell的筛选和克隆化,1.筛选目的：Ab阳性分泌的杂交瘤细胞，ELISA：检测AbAb阳性细胞纯化好的单一性可溶性Ag，包被到微孔上2.杂交瘤的克隆化：2.1定义：用一定方法使混合的cell分离成单个cell独立状态，再经扩大培养形成的各个cell群，就分别是一个克隆，这种方法称为克隆化2.2目的：获得目的Ab阳性，Ab分泌旺盛的杂交瘤cell株2.3克隆化方法：有限稀释法将融合cell用培养液充分稀释，直至每孔只有1个cell显微操作法琼脂平板法细胞选分代法2.4再次克隆化：初次及再次克隆化之前均要检测Ab多次传代，冰冻复苏的杂交瘤cell均要再次克隆化,第二节制备McAb的技术要点,一、免疫小鼠：为防止免疫反应不佳或中途死亡，应同时免疫3-4只小鼠Ag纯选用与骨髓瘤cell同源的BALB/C小鼠二、培养骨髓瘤cell：与待融合脾cell同源选生长旺盛，形态良好，处于对数生长期的cell以供融合用避免cell反祖，用8-AG处理cell切忌过多传代三、收集脾cell分离脾之前，要检测Ab。采脾，制成悬液四、采取饲养cell五、cell融合：是杂交瘤的中心环节，PEG融合,六、检测AbAb检测结果+阳性cell克隆化-更换动物，避免无效试验检测Ab，一般选用ELISA或RIA（放免）目的：找到阳性细胞株七、单个细胞培养八、制备McAb九、阳性细胞的冻存和复苏十、McAb的纯化盐析法粗提半饱和硫酸铵沉淀进一步纯化根据McAb性质层析离子交换层析IgG亲和层析IgG、IgM十一、McAb的鉴定1.Ig类型测定2.特异性测定3.抗体效价测定4.决定簇测定5.亲和性测定KK1/K2K：109-1011L/mol,二、基因工程抗体：,自80年代起开始了基因工程抗体(gene