植物原生质体组织培养PPT课件

-,1,第七章植物原生质体的分离与培养,7.1原生质体培养的意义及分离技术原生质体制备7.2原生质体的培养与植株再生，原生质体的融合及体细胞杂种的鉴定与筛选,-,2,植物原生质体培养和细胞融合,原生质体的分离与培养,概念及研究进展,原生质体融合,-,3,原生质体(protoplast)：脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。,亚原生质体(subprotoplast)在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的减少而形成的一些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。核质体(nuclearplast)由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体。胞质体(cytoplast)不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。,第一节原生质体培养的意义及分离技术,-,4,Protoplastsystem,Organogenesis,Regenerativeability,Ontogenicprocesses,Celldifferentiation,Somaticgenetics,Cellphysiology,Cellcloning,Organelle,DNAuptake,Cellfusion,应用,-,5,植物细胞育种中的核质替换细胞质杂种的获得远缘杂交创造新物种细胞细胞器的互作研究,意义,-,6,植物原生质体的分离和培养,材料预处理原生质体分离的方法原生质体纯化原生质体活力测定影响原生质体数量和活力的因素原生质体培养方法影响原生质体培养的因素原生质体再生过程,Flash,-,7,用于分离原生质体的材料,材料预处理,用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。龙胆试管苗的叶片用4处理较好。甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的原生质体才能分裂。马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体，才能获得高产量。,-,8,-,9,机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。,缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。,-,10,酶解分离法：指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。,常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶Driselase）、果胶酶类（果胶酶和离析酶Macerozyme）、蜗牛酶和胼胝质酶。,-,11,-,12,-,13,酶解法的优缺点,优点：获得量大，适用广泛。缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质。会影响所获原生质体的活力。,-,14,沉降法,漂浮法,不连续梯度法,原生质体纯化的方法,-,15,飘浮法,Protoplast,采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll），使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法。优点：可以避免分离的原生质体因震荡被组织碎片撞击而破损。所用药品简单，成本低。缺点及补救措施：对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体则不易漂浮。可采用不同浓度和不同离心速度分次漂浮的方法。,-,16,沉降法,利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。优缺点：纯化原生质体比较简单。由于原生质体沉积于试管底部，造成相互挤压，常引起原生质体的破碎。,-,17,又称界面法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。优点：可以收集到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。,12mL,碎片带,含原生质体带,0.6mL0.45M蔗糖,0.45M甘露醇,不连续梯度法,-,18,-,19,-,20,-,21,原生质体鉴定,低渗爆破法荧光增白剂法(calcoflowerwhite0.1%),-,22,原生质体活力测定,形态识别形态完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形，放入低渗溶液中，可正常膨大。,-,23,原生质体活力测定,荧光显微镜识别(FDA法)FDA(fluoresceindiacetate)本身不发荧光也不具有极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内FDA可以被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分释放出来。荧光素则不能自由穿越质膜，在完整的活细胞内积累。,使用浓度：0.01%,-,24,原生质体活力测定,酚藏花红染色法（0.1%)酚藏花红能使无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。,伊凡蓝(Evansblue)染色法(0.025%)有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取。,-,25,影响原生质体数量和活力的因素,供试材料及预处理方法酶解条件：酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度渗透压稳定剂质膜稳定剂分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续时间。分离用具,-,26,酶的种类、组合、浓度,几种草本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%),-,27,几种木本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%),-,28,pH,分离原生质体时，酶液的pH值是值得注意的问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH值是不一致的。如制备菜豆叶片原生质体时：低pH（40%）交变电场的振幅频率100V/cm交变电场处理时间20s直流高频电压1100V/cm脉冲宽度60us脉冲次数1,-,57,融合类型,自发融合诱发融合对称融合非对称融合核失活细胞质失活,Flash,-,58,影响原生质体融合的因素,原生质体质量至关重要，高质量的原生质体是细胞融合的首要条件。融合方法融合参数，包括各种融合液都应选择适当。,-,59,融合体类型,异核体(heterokaryon)或异核细胞基因型不同的原生质体融合成杂交细胞同核体(homokaryon)基因型相同的原生质体融合成的杂交细胞非对称杂种或细胞质杂种,-,60,植物体细胞杂交过程示意图,标志,去壁,-,61,植物体细胞的杂交过程,-,62,细胞质工程(cytoplasmicengineering),细胞质工程又称细胞拆合工程是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核质的重新组合，重建成新细胞。可用于研究细胞核与细胞质的关系的基础研究和育种工作。,-,63,细胞质工程,细胞质杂种应用细胞融合技术，使两种来源不同的核外遗传物质与一个特定的核基因组结合在一起细胞质杂种获得途径（4条）：一个正常原生质体与一个去核原生质体融合；Lorz等（1981）用密度梯度离心（550%Percoll，2000040000g，4090min）获得高纯度的去核原生质体。,-,64,细胞质工程,细胞质杂种获得途径一个正常原生质体和一个核失活原生质体融合使核失活的方法：X射线，碘乙酰胺，罗丹明异核体形成后，两个核中有一个消失；较晚时期，染色体选择性消失。,-,65,体细胞杂种产生的其它途径,细胞器移植叶绿体移植叶绿体的来源叶片机械法低速离心原生质体低渗涨破低速离心叶绿体的纯化Percoll或蔗糖密度梯度离心叶绿体的转移夹层离心法和PEG诱导融合应用PEG诱导胡萝卜原生质体摄入藻类叶绿体利用叶绿体的转移使低光效作物的原生质体通过摄取高光效作物的叶绿体而提高其光合效率。,-,66,细胞器移植细胞核移植细胞核的来源植物组织机械法（加TritonX-100）过滤离心原生质体低渗涨破(加TritonX-100)过滤离心细胞核的纯化Percoll或蔗糖密度梯度离心细胞核的转移夹层离心法：原生质体核原生质体核PEG诱导电场诱导和微注射,体细胞杂种产生的其它途径,-,67,体细胞杂种产生的其它途径,微生物移植内吞作用摄入固氮根瘤菌外源染色体和DNA的摄入染色体分离细胞同步化处理原生质体涨破差速离心（200g,10min；1000g，20min）转移方法PEG诱导，显微注射农杆菌介导，基因抢，电穿孔，超声波，激光穿孔,-,68,体细胞杂种选择及杂种植株鉴定,根据可见标记性状的机械选择法,-,69,体细胞杂种选择及杂种植株鉴定,。,FITC(异硫氰酸荧光素)在荧光显徽镜下呈绿色RITC(异硫氰酸罗丹明)RITC在荧光显徽镜下呈红色,-,70,体细胞杂种选择及杂种植株鉴定,根据其遗传和生理生化特性的互补选择法,-,71,互补选择法,互补选择法是指利用两个亲本具有不同遗传和生理特性,在特定培养条件下,只有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。抗性互补选择法营养代谢互补选择法生长互补选择法矮牵牛+爬山虎融合体的选择,-,72,原生质体,矮牵牛,爬山虎冠瘿,混合体,融合处理,矮牵牛+爬山虎,细胞团,愈伤组织,（异核体）,NT培养基,MS培养基(无激素),NT培养基,NT培养基,细胞团,MS培养基(无激素),死亡,MS培养基(有激素),愈伤组织,原生质体,细胞团,MS培养基(无激素),死亡,愈伤组织,-,73,体细胞杂种选择及杂种植株鉴定,细胞学鉴定利用染色体显带技术，以亲本染色体为对照，对细胞杂种的染色体数目、形态和带型进行观察。,-,74,体细胞杂种选择及杂种植株鉴定,同功酶鉴定根据亲本和杂种同功酶谱的差异来鉴别杂种。有的呈双亲谱带的总和、有的出现新谱带或丢失部分亲本谱带。常用的鉴定酶为：乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、过氧化物酶、酯酶等。,-,75,体细胞杂种选择及杂种植株鉴定,DNA分子标记鉴定是在DNA水平上对亲本和杂种植株遗传差异进行鉴定的一种技术。依据DNA的多态性（polymorphism）,RandomAmplifiedPolymorphicDNA,-,76,体细胞杂种选择及杂种植株鉴定,-,77,主要原因：生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以马铃薯番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达受到相互干扰，不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂交植株不能地上长番茄、地下结马铃薯就是很自然的了。,为什么“番茄马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？,-,78,形似白菜味近甘蓝生长期短耐热性强易于储存,-,79,P38思考与探究2,-,80,小结,原生质体是植物除去细胞壁的裸露细胞，是进行各种细胞操作的理想系统。原生质体的分离和纯化是对其操作和培养的前提。分离的原生质体活性受供体材料和分离条件的影响。原生质体培养是细胞工程精细技术，培养技术成熟程度直接影响体系的应用。,-,81,小结,原生质体融合是获得胞质杂种的理想途径。体细胞杂交在远缘育种和新物种、新资源创造中具有深远意义。原生质体融合技术主要有PEG融合及电融合