课题3　血红蛋白的提取和分离

血红蛋白的提取和分离,1.分离生物大分子的基本思路：,选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,2.蛋白质分离和提取的原理：,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。,一、血红蛋白的提取和分离基础知识,3、提取分离方法,凝胶色谱法,凝胶电泳法,（一）凝胶色谱法（分配色谱法）,2.凝胶：,大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的微小多孔球体，内部有许多贯穿的通道。,根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。,1.概念：,一、基础知识,3.凝胶色谱法的原理,当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道而被滞留，路程较长，移动速度较慢;相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。依据的特性是：蛋白质分子量的大小。,1.凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是（）,A,2.利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来（）,A,（二）缓冲溶液,1.概念:,在一定的范围内，凡是能够抵制外界少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。,能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。,2.缓冲溶液作用:,思考：说出人体血液中缓冲对。,NaH2PO4/Na2HPO4,H2CO3/NaHCO3,通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。,4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:_,利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和进行科学研究(活性),磷酸缓冲液,3.缓冲溶液的配制:,其目的是:,（三）电泳：,1.概念：,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,2.原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,影响蛋白质分子运动速度的因素,3.类型:,琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,1、测定蛋白质分子量常用：,N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）,丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应,十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。,2.原理：,SDS能使蛋白质发生完全变性。解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳迁移率完全取决于分子的大小。,3.SDS作用机理:,用SDS测定蛋白质分子量的方法,使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。,3.下列哪些方法能达到物质分离的目的？（）纸层析法同位素标记法染色排除法凝胶色谱法电泳法离心法,D,4.细菌蛋白质在极端环境条件下可通过肽链之间的二硫键维持稳定。已知不同的多肽产物可因分子量不同而以电泳方式分离。下图是一个分析细菌蛋白的电泳结果图，“-”代表没加还原剂，“+”代表加有还原剂，还原剂可打断二硫键，“M”代表已知分子量的蛋白质，右侧数字代表蛋白质或多肽的相对分子量。根据左侧结果，下列哪个图案最能代表该细菌原本的多肽结构（注意：选项中“”代表二硫键）（）,D,二、蛋白质提取、分离实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,样品材料：,蛋白质提取和分离步骤,（一）样品处理与粗分离,可选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液来分离血红蛋白。,2.提问：血液有哪些成分？,1.提问：用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；哺乳动物的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。,每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子O2或一分子CO2，血红蛋白因含有血红素而呈红色。,血红蛋白的特点：,1.红细胞的洗涤:,去除杂蛋白，利于后续血红蛋白的分离纯化.,1、采集血样（要预先加入抗凝血剂柠檬酸钠）2、低速短时间离心（速度越快和时间越长，会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：下层暗红色的红细胞+五倍体积的0.9的NaCl溶液洗涤，搅拌10min5、低速短时间离心：6、重复3、4、5步骤三次上清液中已没有黄色：红细胞洗涤干净。,目的:,操作：,洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白。,注意：,2.血红蛋白的释放：,加蒸馏水到原血液体积,加40体积的甲苯,置于磁力搅拌器搅拌10min,红细胞破裂，释放出血红蛋白,（溶解细胞膜）,（加速细胞破裂）,3.分离血红蛋白溶液：,过程：,第1层（最上层）：甲苯层（无色透明甲苯层）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：红细胞破碎物杂质沉淀层（暗红色）。,滤纸过滤：除去脂溶性沉淀层分液漏斗中静置：分出下层的红色透明液体。,将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min。,试管中溶液层次：,分离：,4.透析：,过程：,目的：,取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h,除去样品中分子量较小的杂质和离子。或用于更换样品的缓冲液。,小结：样品处理和粗分离,1、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；低速短时间离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。2、血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放3、分离血红蛋白溶液：离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。去除小分子杂质。,（二).凝胶色谱操作-,1.凝胶色谱柱的制作：,2.凝胶色谱柱的装填：,教材图519,3.样品的加入和洗脱,血红蛋白的纯化,材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液装填:,2.凝胶色谱柱的装填：,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒洗脱液沸水浴,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,注意：,1、装填时尽量紧密：降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,3、洗脱液液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响分离效果4、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。,50cm高,3.样品加入与洗脱,注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,思考下面的问题：,让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。,1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？,2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？,血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,血红蛋白提取和分离的程序包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。样品的处理：通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，样品的粗分离:透析去除分子量较小的杂质样品的纯化：凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质蛋白纯度鉴定:聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。,3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？,（三）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）,2.试剂的配制：,鉴定血红蛋白纯度。,1.目的：,3.方法步骤：（略）,观察处理的血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,三、实验结果分析与评价,1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,1)、由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。2)、加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。3)、色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,红色区带：均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；说明凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确红色区带：歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,6.下列说法不正确的是（）,B,解析：,血红蛋白溶液离心后分为4层，第一层为无色透明有机溶剂甲苯层，B错误；,7.在装填色谱柱时，不得有气泡存在的原因是（）,解：装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，因为气泡会扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，使得到的红色带区歪曲、散乱，降低分离效果故选：A,解析：,A,8.我们通常选用牛、羊等动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。请回答下列有关问题。(1)实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。其中加入柠檬酸钠的目的是_。此过程即是样品处理，它应包括红细胞洗涤