课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (15)

课题背景,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,问：1尿素如何被利用的呢？,2细菌为什么能分解尿素？,土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,3、常见的分解尿素的微生物,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。,4、课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,学习目标分解,1.知道筛选目的菌株的思路和计数的方法，原理2.掌握从土壤中分离分解尿素的微生物及进行平板计数的方法.,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,1、实例：,DNA多聚酶链式反应(PCR技术)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C左右）的DNA聚合酶。,.筛选菌株,提出的问题如何寻找耐高温的酶？解决问题的思路寻找耐高温环境,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,原理高温淘汰其他菌种，选出耐高温菌种，耐高温菌种提取耐高温酶。,阅读P21-23，思考：1、说出实验室中微生物的筛选原理2、根据本课题所使用的培养基，回答：从物理性质看此培养基属于哪类？该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？3、总结统计菌落数目常用的方法，并据此分析P22（二）中两位同学的结果是否合理。4、分析P22（三）中A同学的实验，想想如何对其结果进行验证,要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，配置合适的培养基。方法：抑制大多数微生物生长造成有利于该菌生长的环境结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,选择培养基,3、本课题所使用的培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体培养基,该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？,此培养基能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？,碳源：葡萄糖氮源：尿素,能。该培养基的唯一氮源为尿素，只有产生脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源而生存。,实验组,对照组,培养基类型,是否接种,目的,结果,以尿素为唯一氮源的培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,是,是,分离分解尿素的细菌,判断该培养基有无选择性,只生长分解尿素的细菌,生长多种微生物,怎样证明此培养基具有选择性呢？,1、显微镜直接计数：,可以利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,.统计菌落数目：,不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；个体小的细菌在显微镜下难以观察,缺点,2.间接计数法（活菌计数法）（1）常用方法：,每克样品中的菌株数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。,（2）原理：,稀释涂布平板法,思考：活菌计数法统计的菌落数是否与活菌实际数目吻合？为什么？,统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只有一个菌落因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。,例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的做法正确吗？如果有问题，错在哪？,甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值注：误差太大，须重做或再多设几组,?,注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值将同一稀释度至少涂布三个平板作重复组，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数来表示。每克样品中的菌株数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。1、A同学筛选出150个菌落。2、B同学筛选出50个菌落。B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。,?,原因：土样不同培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照组的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：a.如果结果与A同学一致，则证明A无误；b.如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,.设置对照：,控制变量,设置对照的方法：,空白对照：不给对照组任何处理因素。,条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素。,自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。,相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。,练习：判断正误：1、根据培养皿中菌落数可以准确计算样品中含有的活菌实际数目（）2、只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素（）3、筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的唯一氮源（）4、统计样品中的活菌一般用平板划线法（）,【巩固1】分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是()。加尿素不加尿素加琼脂不加琼脂加葡萄糖不加葡萄糖加硝酸盐不加硝酸盐ABCD,【巩固2】用来判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置的对照是()。A.未接种的选择培养基B.未接种的牛肉膏蛋白胨培养基C.接种了的牛肉膏蛋白胨培养基D.接种了的选择培养基,C,C,阅读P23-26，思考：1、说出土壤取样的原因和操作方法2、说出样品稀释的目的，熟记细菌、放线菌、真菌的稀释倍数3、熟记细菌、放线菌、霉菌的培养温度和时间4、说明鉴定该种细菌能够分解尿素的方法,二、实验设计：,二.实验设计.土壤取样同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。取样要求：先铲去表层土3cm左右，再取样取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。P25.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,（三）样品的稀释,应在火焰旁称取土壤10g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。P25在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。,在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养。以保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板。细菌稀释度为104、105、106放线菌稀释度为103、104、105真菌稀释度为102、103、104,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？,原因：土壤中各类微生物的数量是不同的。结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,测定土壤中细菌的数量一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用102、103和104倍稀释。其原因是（）A.细菌个体小，真菌个体大B.细菌易稀释，真菌不易稀释C.细菌在土壤中的数量比真菌多D.随机的，没有原因,C,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,.取样涂布,.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间：细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528培养34d,一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种我微生物表现出稳定的菌落特征。包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。,微生物的培养与观察,思考在研究未知微生物时务必规范操作，以防被感染，实验后一定要洗手。,致病微生物,三、操作提示,P25,1、无菌操作2、做好标记3、制定计划,为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先制定计划。,四.结果分析与评价(一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落通过对照实验，若培养物有杂菌污染，对照的培养基菌落数偏高；若培牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数远大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。,（二）样品的稀释操作是否成功及重复组的结果是否一致提示：如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明实验不精确，需要重新实验。,五.课外延伸,在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,测定饮水中大肠杆菌数量的方法-滤膜法。是将一定体积的水过滤后，将滤膜放到伊红美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过计数得出水样中大肠杆菌的数量。,大肠杆菌呈黑色中心,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征,本课题知识小结:,1下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是（）A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1mL，分别涂布于各组平板上C将实验组和对照组平板倒置，37恒温培养2448hD确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数,实践训练,D,2.判断：利用稀释涂布平板法既能分离微生物也能对微生物进行计数接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单个菌落以尿素为唯一氮源且含酚红的培养基可选择和鉴别尿素分解菌,3尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌（目的菌），培养基成分如表所示，实验步骤如图所示，请分析回答问题：（1）培养基中加入尿素的目的是筛选到_，这种培养基从功能上属于_培养基。（2）“目的菌”生长所需的氮源来自培养基中的_，其同化作用类型是_。,目的菌,选择,异养型,尿素,将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到100mL,（3）下图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图。则获得图A效果的接种方法是_，图B效果的接种方法是_，一同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是_（答出一条即可）。,稀释涂布平板法,平板划线法,菌液浓度过高,（4）在进行分离分解尿素的细菌实验时，某同学从培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落，该同学的实验结果产生的原因可能有_（填序号）由于土样不同由于培养基污染由于操作失误没有设置对照,4.饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸收利用，还影响对其他营养物质的利用。若在饲料中添加植酸酶，则能催化其水解成为可以吸收利用的磷酸盐等。以下是科研人员从作物根部土壤中分离产植酸酶的菌株的过程示意图。请分析作答。(1)培养基中除了添加植酸钙以外，应含有_、_、水、无机盐等基本营养物质。,碳源,氮源,(2)分离产植酸酶的菌株，需先配制合适的培养基，配制培养基时，在各成分都溶化后和分装前，要进行的是_和灭菌。对培养基进行灭菌的常用方法是_。通常每种稀释液需涂布_个平板，取其平均值。若将最后一个试管中的菌液每次吸取0.1mL涂布培养后获得平均值是C，则1g土壤中含有此菌的菌株数是_个。,调节pH值,高压蒸汽灭菌,3,C106,(3)为防止杂菌污染，要对培养基和培养皿等进行_，而且须将接种后的培养皿呈_状态放置。(4)接种以前进行的一系列操作，目的是在培养皿表面形成_。根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的_就能大致推测出样品中的活菌数。,灭菌,倒置,单个菌落,菌落数,5微生物与人类关系密切。虽然有些微生物能使动植物患病，但多数微生物对人类是有益的，请回答下列有关问题：(1)下表为两种微生物的培养基配方。,B培养基：,A培养基：,将上述两种培养基中的物质分别溶解后，均用蒸馏水定容到1000mL。,B培养基：,A培养基：,(1)如果要进行土壤中分解尿素的细菌的分离，则需要选择上述哪种培养基？_，该培养基能分离尿素分解菌的原因是：在该培养基中可加入_指示剂，根据指示剂的颜色可鉴定该种细菌能够分解尿素。从功能上来看，上述两种培养基均属于_培养基。,A培养基,培养基中尿素为唯一氮源，只有能分解尿素的微生物才能生长繁殖,酚红,选择,(2)把牛肉膏蛋白胨固体培养基倒入平板，等培养基冷凝后，应将平板_放置，这样做的目的是可防止_造成污染。(3)微生物接种的方法很多，平板划线法操作结束时，为什么仍需要灼烧接种环？_。(4)微生物培养过程中还有什么方法或步骤要防止其他微生物污染？_、_、_。,B培养基：,A培养基：,倒过来,皿盖上的水珠落入培养基,杀死接种环上残留菌种，避免污染环境和感染操作者,培养基灭菌,接种环境灭菌,接种过程无菌操作,6.尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如下表所示，实验步骤如图所示。请分析回答问题：,(1)培养基中加入尿素的目的是_，这种培养基属于_培养基。(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的_和_，实验需要振荡培养，原因是_。(3)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入_，细菌合成的_将尿素分解为氨，pH增高，使指示剂变红。,