基因工程练习题2016

1基因工程双语练习题第一章绪论1、孟德尔法则的基本假设是生物体的遗传特性由一种因子控制，这种因子称为（基因）。它是存在于细胞之中的某种物质颗粒。2、孟德尔所提出的，我们现在称之为遗传第一与第二原理的重要发现被埋没了近（30）年，一直到二十世纪初才又被别人再度发现。3、孟德尔提出的遗传规律埋没30年后，又被三位科学家再次发现，这三位科学家不包括（1）荷兰的植物学家HUGODEVRIES,（2）德国的植物学家KARLCORRENS（3）奥地利的植物学家EVONTSCHERMAK（4）美国科学家THMORGAN4、孟德尔法则的再次发现标志着遗传学的诞生，当时这门科学的主要目的是试图研究（基因是什么，它们是如何工作的）（1）基因是什么，它们是如何工作的（2）基因在那里，它们是如何工作的（3）基因是不是蛋白质（4）基因是不是核酸5、基因在染色体上的思想是1903年（WSUTTON）提出来的，并得到了1910年（THMORGAN）实验的支持。6、摩尔根等发现了（基因图谱GENEMAPPING）技术，到1922年已经对果蝇4条染色体上的2000多个基因的相关位置进行了广泛的分析，他用的具体的实验材料是（黑腹果蝇DROSOPHILAMELANOGASTER）。7、1902年，博韦里（TBOVERI）和萨顿（WSSUTTON）指出，染色体在细胞分裂中的行为与孟德尔的遗传因子平行。8、艾弗里（OTAVERY）最为人称道的贡献是在遗传学方面。1944年，他与他的同事麦克劳德（MACLEOD）和麦卡蒂（MCCARTY）提供了DNA是遗传物质的第一个直接实验证据，从而导致1953年沃森克里克提出DNA（双螺旋结构模型），由此诞生了分子遗传学，开创了生命科学的新纪元。9、麦克斯德尔布吕克（MAXDELBRUCK）在科学上的主要贡献是开创了噬菌体遗传学的研究。10、50年代，ECHARGAFF研究了不同生物的DNA分子组成之后，发现一些共同规律，这些规律现在称为（CHARGAFF准则）。211、1952年，奥地利裔美国生物化学家查伽夫（ECHARGAFF，1905）测定了DNA中4种碱基的含量，发现其中腺膘呤与胸腺嘧啶的数量相等，鸟膘呤与胞嘧啶的数量相等。这使（沃森、克里克）立即想到4种碱基之间存在着两两对应的关系，形成了腺膘呤与胸腺嘧啶配对、鸟膘呤与胞嘧啶配对的概念。12、在ECHARGAFF等人的研究基础上，WATSON和CRICK根据DNA的X射线衍射图及化学分析的结果，于1953年提出了著名的关于DNA的双螺旋DNADOUBLEHELIXMODLE结构的模型。13、雅克莫诺JACQUESLMONOD是20世纪中期一位杰出的分子生物学家。他和F雅各布等人一起在分子水平上探讨了基因的调控机制，创立了（操纵子）理论。14、1973年（COHEN）完成了第一例成功的克隆实验。基因工程的概念GENETICENGINEERING应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其表达产物。请简述基因克隆的基本过程或基本步骤THEBASICSTEPSINAGENECLONING答案基因克隆实验的基本步骤如下第一步含有被克隆基因的DNA片段首先要插入到称为载体的环状DNA分子中，产生出嵌合体或重组DNA分子。第二步作为运载工具的载体将基因转移到宿主细胞中，这些宿主细胞通常为细菌，也包括其他类型的活细胞。第三步在宿主细胞内载体进行复制，这里不仅载体本身能够复制，其携带的基因也同样的进行复制。第四步当宿主细胞分裂时，重组DNA分子的拷贝被传递给子代细胞，更多的载体发生复制。第五步大量的细胞分裂后，产生确定的宿主细胞的菌落或克隆。克隆内的每一个细胞都包含了一个或更多的重组DNA分子的拷贝，这时候我们可以说重组DNA分子携带的基因就被克隆了。第2章基因克隆载体质粒和噬菌体一、简答题简述质粒的基本特征1、质粒是一种能够在细菌细胞中独立生活的环状DNA分子。2、质粒上总是携带一个或多个基因，在实验室中抗生素抗性基因常常作为选择标记以能够确定培养物中的细菌包含某种特定的质粒。例如RP4这个质粒子就携带对氨卞青霉素、四环素、卡那霉素等抗生素的抗性基因。因此，仅仅含有RP4或相关质粒的大肠杆菌能够在含有一种或多种抗生素的培养基中生存和生长。33、所有质粒至少含有一个充当复制起点的DNA序列，因此能够在细胞中独立于主要染色体之外进行复制，例如非整合型质粒子就是这样。一些质粒也能插入到染色体中进行复制，整合型质粒子就是这样。二、填空题1、对质粒而言，作为一个理想克隆载体的适当范围是小于（10KB）。但较大的质粒在某种情况也适合于克隆。2、质粒的大小范围在（10KB250KB）之间。3、质粒分成两个组群接合性的和非接合性的，接合性的质粒的特征是能够促进细菌细胞之间的（性接合）。4、为了能在同一细胞内共存，不同的质粒一定是相容的，如果两种质粒不相容，那么一种或另一种将迅速地从细胞内消失，因此不同的质粒依是否能共存而分成不同的不相容群。三、名词解释1、质粒的拷贝数一般是指单个细菌细胞中发现的单一质粒的分子数目，一般在细胞内用于克隆载体的质粒以多拷贝形式存在以获得大量的重组DNA分子。2、致育（FERTILITY）质粒（又称F质粒）仅携带转移基因，并且能够促进质粒间有性接合的转移外，不再具备其他的特征，如大肠杆菌中的F质粒。3、耐药性质粒（RESISTANCE）质粒或称“R”质粒携带有能够赋予宿主细胞对某种或多种抗菌药的耐药基因，如抗氯霉素，抗氨卞青霉素，抗水银等的抗性基因。R质粒因其通过正常繁殖而传播，在临床微生物学上具有重要作用，能够对细菌感染的治疗产生深远的影响，如RP4通常在（假单胞菌）中发现，但也能在其他菌中出现。4、COL质粒编码大肠杆菌素，一种能够杀死其他细菌的蛋白，比如大肠杆菌的COLE1质粒。5降解质粒（DEGRADATIVEPLASMID）使宿主菌能够代谢一些通常情况下无法利用的分子，如甲苯、水杨酸，例如假单胞菌中的TOL质粒。6、毒性质粒（VIRULENCEPLASMID）赋予宿主菌致病性，比如根瘤农杆菌中的TI质粒，能够在双子叶植物中诱导冠樱瘤。简答题一、简述噬菌体的基本特征（BASICFEATURESOFBACTERIOPHAGES）1、噬菌体一般是专一侵染细菌的病毒。像所有病毒一样，噬菌体的结构十分简单，仅仅由携带若干基因的DNA（偶尔也有RNA）组成，包括几个用于噬菌体复制的基因，同时被由蛋白质组成的衣壳包围着。2、裂解性侵染循环的特定特征是噬菌体的DNA复制紧随衣壳蛋白合成之后发生，并且噬菌体DNA决不会稳定地在宿主细胞内存在。与裂解性侵染循环相比，溶源性感染的特征是也许细胞经过上千次的分裂后，噬菌体DNA分子仍保留在宿主菌内。噬菌体4是典型的溶源性噬菌体，其侵染循环就是这种类型的。3、有限的几种溶源性噬菌体进行着一种相当不同的侵染循环，当M13噬菌体或相关噬菌体侵染大肠杆菌时，新的噬菌体颗粒不断的组装并且从细胞不断的释放。它不整合到细菌基因组中去也不会保持静止，这样细胞决不会发生裂解，被侵染的细胞继续生长分裂，只是比未被侵染的细胞更慢一些。4、尽管有很多种噬菌体，仅和M13被发现可以作为克隆载体。二、简述DNA分子中基因组织方式1、通过基因图谱和DNA测序技术的细致研究发现DNA分子的大小是49KB。研究结果已经搞清了DNA分子上的基因的位置和特征。2、噬菌体的遗传图谱的特点是，相关功能基因在其基因组上成簇聚集在一起。例如，所有编码衣壳组分的基因都成群聚集在分子的左手1/3处；控制前噬菌体整合到宿主基因组上的基因成簇聚集在分子的中部。基因成簇排列对控制基因组的表达具有十分重要的作用，因为它使基因以一个群体开闭，而不是单一进行。另外，基因成簇排列在基于噬菌体的克隆载体的构建也是十分重要的。3、现已证明在克隆载体的构建过程中，噬菌体的第二个重要特征是其DNA分子的构型。带有两个游离端的线型分子代表着在噬菌体头部中DNA分子存在方式。这种线型分子由两链条互补链组成，分子的两端各含有一个由单链形式存在的短的12核苷酸的延伸区，这两条单链是互补的，因而能够相互配对形成环状的完整的双链分子。互补的单链常常称作粘性末端，因为它们之间的配对能把DNA的两段粘在一起。4、分子的粘性末端被称作柯斯位点（THECOSSITES），在噬菌体侵染周期中起着两种截然不同的作用。首先，该位点允许注入到细胞中的线型DNA分子环化，而环化是插入基因组的先决的必要条件。柯斯位点（THECOSSITES）的第二个作用是相当不同，它是在前噬菌体切离宿主基因组之后开始起作用。在这一阶段，新的DNA分子通过滚环复制机制不断地从模板分子上滚落，结果产生了由带有柯斯位点（THECOSSITES）的一系列线型分子组成的连环体。此时，柯斯位点的作用是充当在柯斯位点处切割连环体的限制性内切酶的识别序列，从而产生单一的噬菌体基因组。该内切酶由DNA基因组上的A基因产生，它不仅能够切割产生单链的粘性末端也和其他的蛋白质联合作用把各个噬菌体的基因组包装进噬菌体的头部结构中去。三、简述噬菌体M13的主要特征，回答为什么它是一种很有吸引力的适合构建克隆载体噬菌体1、噬菌体M13是单连丝状DNA噬菌体，其分子小于基因组，长度仅为6407个核苷酸大小，分子是环型的通常是完整的单链DNA分子。2、它是一种很有吸引力的适合构建克隆载体噬菌体。基因组大小小于10KB，恰好处于有潜力的载体的理想范围内。另外，M13基因组的双链复制型（RF）的行为很像质粒，能够同样的处理以适应实验目的。它易于从感染的大肠杆菌中制备也可通过感染再次导入。53、特别是使用基于M13载体克隆的基因能够以单链形式获得。克隆基因的单链副本可以用于几个技术中，例如有名的DNA测序和体外突变。对于这种类型的工作，使用M13载体获得单链DNA是一种容易而可靠的方式。第三章从活细胞中纯化DNA一、填空题1、在不同时间，我们要进行基因克隆实验一般至少要制备三种不同种类的DNA,他们是（细胞总DNA）、（纯化的质粒子DNA）、（噬菌体DNA）。2、从细菌细胞中制备总DNA的方法可以分成哪四个阶段答案（1）细胞培养物的生长和收获。（2）细胞被转移并破碎以获得细胞提取物。（3）DNA从细胞提取物中纯化。（4）DNA被浓缩。3、LB培养基的主要成分是（蛋白胨）、（酵母提取物）、（氯化钠）。二、简答题1、简述细菌培养物的生长和收获（1）37下，LB培养基在摇床上以150250RMP通气培养，大肠杆菌细胞每大约20分钟分裂一次，直到达到最大浓度，大约每毫升内含23109个细胞为止。（2）培养物的生长可以通过读取600NM处的OD进行检测，此波长下，1OD相当于每毫升菌液中含有08109个细菌。（3）为了制备细胞提取液，提取的细菌细胞尽可能处于较小的体积中，因此要在离心机上进行旋转离心以收获细菌。（4）相对较低的速度就可以将细菌离心到离心管管底，接下来要把培养基成分倒掉，在细菌的最大浓度下，1升培养物中的细菌可以再悬浮于在10ML的体积内。由此细菌培养物得以浓缩。2、请问如何制备细胞提取物（ACELLEXTRACT）（1）破碎细胞的技术可分为物理和化学两种方法，当你的实验目地是DNA制备时，对大肠杆菌而言常常使用化学方法。（2）化学裂解一般使用一种药品攻击细胞壁用另一种药品破坏细胞膜。（3）使用什么化学药品要依细菌的种类而定，但对于大肠杆菌或相关的有机体来说，弱化细胞壁的韧性时，往往采用溶菌酶、乙二胺四乙酸EDTA或两者混合使用。（4）溶菌酶是存在于蛋清或眼泪和唾液中的一种酶，能消化多聚复合物使细胞壁产生脆性。（5）另一个方面，EDTA能移除镁离子，而镁离子对维持细胞壁的完整结构是必要的，同时它也能抑制细胞中的酶对DNA的降解。6（6）在某些情况下，使用溶菌酶或EDTA足可以使菌体细胞破裂，但通常还要加像十二烷基磺酸钠（SDS）那样的去垢剂。去垢剂通过去除脂类分子而促进裂解过程，因此引起细胞膜的破裂。（7）裂解细胞后，制备细胞提取物的最后一步是去除不容的细胞碎片，例如部分消化的细胞壁碎片等组分可以通过离心去除，这样细胞提取物就保留在上清中而得以制备。3、得到细菌细胞提取物之后，你如何从提取物（ACELLEXTRACT）中纯化DNA（1）除了DNA外，细菌细胞提取物中还包含大量的蛋白质和RNA，可以使用不同的方法去除这些污染物，已得到纯净的DNA。（2）去除提取物中蛋白质的标准方法是加入苯酚或苯酚和氯仿（11）的混合物，这些有机溶剂能够使蛋白质沉淀下来，而把核酸（DNA和RNA）保留在水相中。这样提取物轻轻与这些有机溶剂混合，用离心方法分层，沉淀的蛋白质分子就在有机相和水相之间凝结成白色的团快。（3）一些RNA分子，特别是MRNA分子通过苯酚处理可以去除，但大多数RNA分子仍同DNA分子混合在水相中。唯一有效的去除RNA的方法是使用核糖核酸酶，该酶能把RNA分子降解成核糖核酸亚单位。4、如何对得到的DNA样品进行浓缩一般采用乙醇沉淀的方法对DNA样品进行浓缩。5、有人已经制备出了大肠杆菌基因组DNA，让你测量一下DNA的浓度，你会采用什么方法如何进行（1）要进行基因克隆实验，确切的知道溶液中有多少DNA是十分重要的，紫外吸收分光光度测定法能够精确地测量DNA的浓度。（2）DNA溶液的紫外光吸收的数量直接与样品中DNA的含量成比例。（3）通常在260NM处测量光吸收值，在该波长下A260，对于一个纯的DNA样品来说，1个光吸收值（1OD）相当于每MG样品中含有50G的双链DNA。（4）另外紫外光吸收也能用来检测DNA制备物的纯度，A260/A280是18，如果这个比值小于18，说明制备物被污染了，不是污染了蛋白质就是污染了苯酚。6、简述质粒制备的一般原理（1）在制备质粒的过程中，将质粒DNA与同处于细胞中的细菌染色体DNA分开总是必要的。有几种基于质粒和细菌DNA物理特性不同而采用的方法，特别明显的就是大小的差异。（2）常用的质粒载体大小一般在1KB至10KB之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和PBLUESCRIPT（简称PBS）等。细菌的基因组大小约5106BP，约含3000个基因。（3）除了大小外，质粒和细菌DNA的构象也不同。大多数质粒以超螺旋分子存在于细胞中，这种超螺旋结构仅当两条多聚核苷酸链保持完好的情况下保持稳定，因此更专业的说法称为CCCDNA。（4）碱裂解法的基础是要有一个狭窄的PH范围。在该范围内非超螺旋DNA变性而7超螺旋的质粒不变性。如果把氢氧化钠加到细胞提取物中，调PH到120125狭窄的PH范围，非超螺旋DNA氢键断裂，引起双螺旋解开，两条多聚核苷酸链分离。（5）如果此时加入酸，这些变性的菌体DNA链聚成一团，通过离心能将不溶解的网状结构析出，在上清中就保留了质粒DNA。第四章DNA纯化后的利用填空题1、一旦制备出DNA样品，基因克隆的下一步工作是构建重组DNA分子。2、构成基因克隆基础的切割和连接操作要通过称为（限制性核酸内切酶）和（连接酶）实现。简要题一、DNA操作酶的范围（也可以作为填空题）DNA操作酶依其催化的反应类型分成（5）大类。（1）核酸酶是能切割、缩短、降解核酸分子的酶。（2）连接酶能够把核酸连接在一起。（3）多聚酶能使分子进行复制。（4）修饰酶能去除和填加化学基团。（5）拓扑酶能引入和去除CCCDNA的超螺旋结构。选择题关于核酸酶下列说法不正确的是（1）外切酶的作用方式是从DNA分子的末端逐一切去核苷酸。（2）内切酶能够切断一个DNA分子中内部的磷酸二酯键。（3）不同核酸外切酶的主要区别在于攻击双链分子时所降解的链的数目不同。（4）内切酶不能切断一个DNA分子中内部的磷酸二酯键。填空题1、BAL31是从一种（海洋）细菌（ALTEROMONASESPEJIANA）中纯化得到的，它是一种核酸外切酶，能够去除双链分子两条链上的核苷酸。这样该酶作用分子的时间越（长），得到的片段越（短）。2、ECOLIEXONUCLEASEIII只降解双链分子的一条链，得到（单链分子）产物。3、核酸内切酶的分类标准与外切酶（相同），内切酶S1来自于（ASPERGILLUSORYZAE米曲霉），一种真菌，而DNASEI制备于（牛的胰腺），既能切割单链分子又能切割双链分子。4、另外，（限制性核酸内切酶）是一种特殊类群的酶，仅仅在有限数目的（特异识别位点）切割双链分子。5、在细胞内，（连接酶）的功能是在复制期间修复双链DNA分子上产生的单链（缺失）DISCONTINUITIES，大多数生物产生的这种酶能把双链分子的两个独立片段连接在一8起。6、DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺失DISCONTINUITIES酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5PO4与另一DNA链的3OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的T4DNA连接酶除外，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。7、DNA聚合酶，以DNA为复制模板，从将DNA由（5端）开始复制到（3端）的酶。8、在50年代的中期，AKORNBERG等就想到DNA的复制必然是一种酶的催化作用，经过大量的工作，于1956年终于发现了（DNA聚合酶）（DNAPOLYMERASE，DNAPOL）原来称为KORNBERG酶。9、DNA聚合酶能合成与已有的（DNA或RNA）模板互补的能的DNA链，大多数聚合酶只有模板具有一个双链区域下才能发生作用，该区域充当聚合起始的引物结合区。简答题一、简述通常用于基因工程的4种聚合酶（1）第一种聚合酶是DNAPOLYMERASEI，来源于大肠杆菌（ECOLI）。该酶作用于主要双链DNA分子的单链区域（NICK缺口），合成互补的新链，在催化过程中同时还降解已有的分子链。因此它是具有双重活性的酶，即（聚合和降解）。（2）DNAPOLYMERASEI的核酸酶活性位于多肽的最初的323氨基酸分子处，移除该片段后使酶更改，更改后的酶保留了聚合酶的功能但不再有降解活性，称为KLENOW片段。（3）TAQDNAPOLYMERASE用于PCR反应，它是一种（耐热细菌）THEMUSAQUATICUS的DNAPOLYMERASEI。（4）逆转录酶专门在几种病毒的复制上发挥作用。它有一种独一无二的作用，它使用的模板不是（DNA）而是（RNA）。这种以RNA模板合成互补DNA链的性质是称为（CDNA）技术的核心内容。二、简述DNA分子的修饰酶的种类和性质（1）有多种酶可以通过添加或移除特异的化学基团而对DNA分子进行修饰。（2）碱性磷酸酶（ALKALINEPHOSPHATASE）可来自大肠杆菌、小牛肠组织和北极虾。它能去除位于DNA分子5端的磷酸基团。（3）多核苷酸激酶（POLYNUCLEOTIDEKINASE）来源于侵染T4噬菌体的大肠杆菌，其作用与碱性磷酸酶（ALKALINEPHOSPHATASE）相反，将磷酸基团加到游离的5末端。（4）末端脱氧核苷酸转移酶（TERMINIALDEOXYNUCLEOTIDYLTRANSFERASE）来源于小牛的胸腺组织，能将一个或多个脱氧核苷酸加到DNA分子的3末端上。填空题最后一种DNA操作酶是拓扑酶（TOPOISOMERASES）可以通过引入或去除（超螺旋）而使CCCDNA（如质粒DNA）的构像发生改变。9论述题一、结合限制性核酸内切酶的发现简要论述该类酶，特别是II型限制性核酸内切酶在基因工程实验中的重要意义（1）基因工程要求DNA分子要以十分精确而且可再生的方式被切割，在重组DNA构建时，载体被切割的方式足以说明这一点。必须在单一的位点切割每个载体分子，以打开环状分子使新的DNA分子插入。通常被克隆的DNA分子也有必要被切开。（2）纯化的限制性核酸内切酶允许分子生物学家按基因工程要求以精确而可再生的方式切割DNA分子。这些酶的发现致使三位科学家（WARBER,HSMITHANDDNATHANS）获得了1978年的诺贝尔奖金，是基因工程发展的突破性进展之一。（3）最初的观察研究致使20世纪五十年代发现了限制性核酸内切酶。当时的结果显示，一些菌株对噬菌体的感染具有免疫力，是一种被称为宿主控制性限制的现象。（4）II型限制性核酸内切酶的集中表现的特征是每一种酶都有一个特异性识别序列，并在该处将DNA分子切开。一条链上的识别序，给出的方向是由5端到3端。（5）几乎所有的识别序列都是回纹结构（PALINDROMES），即当考虑到两条链时，在每条链的各自的方向上，这些序列读起来相同，例如ECORI的识别序列是5GAATTC33CTTAAG5（6）设计基因工程实验时，限制性核酸内切酶产生的切口的确切的性质是特别重要的。许多限制性核酸内切酶在识别序列中间直接切割双链，产生平末端或平端。PVUIIANDALUI切出的切口就是平末端的。（7）然而，相当多的限制性核酸内切酶切割DNA的方式略有不同。这些酶确实不在同一位点切割双链DNA分子。切口有两个或四个核苷酸交错。这样一来，产生的DNA片段在切口端都有短的单链悬垂部分。这些部分叫做粘性末端或叫黏端。因为它们之间的碱基配对可把DNA分子在粘在一起。粘端酶的一个重要特性是带有不同识别序列的限制性核酸内切酶可以产生相同的粘性末端。BAMHI识别序列为GGATCC和BGLII识别序列是AGATCT都产生GATC粘性末端。二、在一定假设的条件下，一个已知长度DNA分子的识别序列的数目是可以通过数学方法计算的请回答这个假设条件是什么举例说明数学上计算的识别序列数目与实际识别序列数目有什么差异，这种不同又说明了什么（1）在一个已知长度的DNA分子上，某种特定限制性核酸内切酶识别序列的数目是可以通过数学方法计算出来的。对于四核苷酸序列例如GATC，每44265个）核苷酸有一个识别序列；对于六核苷酸序列，每464096个）核苷酸有一个识别序列。（2）这种算法的假设是核苷酸以随机方式排列同时四种核苷酸以相等比例存在（例如，GC含量占50。（3）实际上，这两个假设没有一个是完全有效的。例如，DNA分子（大小为1049KB）对拥有六核苷酸的识别序列的限制性合算内切酶来说，应该有12个位点。（ONCEEVERY464096）（4）实际上，这些识别位点发生的频率都不足，例如很小）实际上，这些识别位点发生的频率都不足，例如很小BGLII有6个，BAMHI有5个，SALI仅仅有2个，这个事实反映了，这个事实反映了GC的含量远小于50。也反映了DNA分子的核苷酸不是随机排列的。三、请叙述用限制性核酸内切酶BGLII酶切DNA（浓度为125G/ML）方法（1）首先将一定数量的需要酶切DNA吸入一个离心管中，吸入的DNA数量要依实验的性质而定。在这次实验中，我们要酶解2G的DNA（根据给定的浓度我们取16L样品即可），因此我们需要微量移液器。（2）大多数限制性核酸内切酶一般适合在PH74条件下发挥功效。不同的酶依离子强度的不同而有所变化（离子强度一般由NACL和MG2浓度提供，所有II酶都需要MG2激活。还需要加入某种还原剂，如二硫苏糖醇DTT，以稳定酶防止酶失活。（3）为了方便起见，我们定义一个酶单位为一小时酶切1GDNA的所需要的酶的数量。（4）最后要考虑的是反应温度。大多数限制性核酸内切酶（包括BGLII）一般在37酶解效果最好，但也有个别的酶有所不同。酶解应该在一个小时后完成。（5）如果由酶切产生的DNA片段是用来进行克隆实验，那么必须要以某种方式破坏所使用的酶，目的是使它不会意外地降解后期所加入的其他DNA分子。有许多方法可以使用破坏酶的活性，可以在7075短暂保温、可以使用苯酚提取、也可以加入EDTA鳌合MG2，阻止酶活性。四、普通电泳能否检验不同大小DNA分子的酶解片段，为什么凝胶电泳检验DNA分子酶切片段的原理是什么（1）DNA分子，像蛋白质和其他生物复合物一样，携带有电荷，就DNA分子而言，常常带有负电荷，结果当DNA分子放在电场中时，他们将向正极迁移。分子的迁移率依赖于两个因素分子的形状和电荷/质量的比值。不幸的是大多数DNA分子的形状相同，电荷/质量的比值类似，因此不同DNA大小的片段不能用普通电泳进行分离。（2）最后这些问题在20世纪70年代初随着凝胶电泳的发展而得以解决。如果电泳在凝胶中进行，DNA分子的大小变成了一个可以考虑的因素。凝胶通常由琼脂糖、聚丙烯酰胺，或二这的混合物组成，他们组成了网孔结构，DNA分子经过这些网孔到达正极。DNA分子越小，他们向正极迁移的速度越快，因此凝胶电泳可根据分子的大小将他们分离。五、简述使用凝胶电泳中EB的作用，效果如何，还存在那些缺点（1）最容易看到凝胶电泳结果的的方法是用可使DNA可视化的化合物对凝胶进行染色。EB（溴化乙锭）通常用于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中DNA的染色。（2）只要有充足的DNA存在，EB染色后，在紫外光照射下，染色条带显示了不同11大小的DNA片段的位置。（3）不幸的是，这种染色方法十分危险，因为EB是一种很强的诱变剂同时使DNA可视化的紫外光也能引起严重的灼伤。六、电泳后如何对DNA分子的大小进行估计，有几种方法，各自特点如何（1）最精确的方法是充分利用通过数学关系将迁移率与分子的重量联系起来，相应的公式是DABLOGM，这里，D是分子移动的距离；M是分子的重量；A和B是依赖于电泳条件的一个常数。（2）一般情况下，我们常常使用更简单的方法来估计DNA片段的大小，这种方法尽管不很精确。在所跑的凝胶中，一般包括由已知大小组成的标准酶切产物MARKER。七、连接酶在体内发挥着怎样的作用在试管内构建重组DNA分子过程中，连接酶是的作用有什么不同（1）构建重组DNA分子的最后一步是将载体分子与要克隆的DNA连接在一起。这一过程称做连接，催化连接反应的酶叫连接酶。基因工程常用的连接酶通常纯化于侵染T4噬菌体的的大肠杆菌。（2）在细胞内，这种酶在修复双链中的一条链上产生的缺失（断裂区域DISCONTINUITIES）的过程中起在功能上着十分重要的作用。断裂区域（DISCONTINUITIES）是指一个十分简单的位置，在该位置上相临核苷酸之间的磷酸二脂键已经缺失。相比之下，缺口（NICK）是指在一定位置上一个或多个核苷酸不存在了。（3）在试管中的纯净的连接酶，不但能修复单链上的断裂，也可以将单独的DNA分子或同一分子的两个末断连接在一起。除了必须连接两个（每条链各有一个）磷酸二脂键外，连接反应与体内的DNA分子的断裂修复完全相同。八、为什么在试管内连接酶连接粘性末断比平末断更有效（1）在试管内可以用连接酶把两个平末段的分子连接在一起。但这种连接不是十分有效的。（2）相比之下，互补的粘性末端连接起来更有效。这是因为互补的粘性末端可以通过氢键相互配对，形成一种相对稳定的结构，以利于连接酶发挥作用。（3）如果粘性末端不能迅速地合成磷酸二脂键，他们还会分开。然而在这个过度时期，碱基配对形成的这种结构确实可通过延长末端相互接触的时间来增加连接效率。九、一般情况下，载体有粘性末端而需克隆的DNA片段是平末端的，在这种情况下怎样使用连接子（LINKERS）和接头（ADAPTORS）将载体和克隆片段连接起来，在连接过程中会出现什么问题，又是如何解决的（1）如果载体是粘性末端而需克隆的DNA片段是平末端的，要想将载体与克隆的片段连接起来可以采用连杆和接头。（2）连杆（LINKERS）是在试管中合成的已知核苷酸序列的的双链DNA短片段分子。12它是平末端分子，带有限制性位点（如BAMHI的识别位点）。DNA连接酶可以将连杆和平端DNA分子连接在一起。尽管是平末端连接，但这种特别的连接反应可以有效的进行，这是因为合成的这种寡聚核苷酸（连杆）的数量特别多，可以高浓度加入到连接混合物中去。这样在DNA分子的各端会有不只一个连杆靠近，形成链式结构。（3）然而用BAMHI进行消化，将在识别序列处切割这条链，将会产生大量的已被切割的连杆和携带有BAMHI的粘性末端的原始DNA片段，这种更改后的片段可以与BAMHI切割的克隆载体相连。（4）使用连杆有一种潜在的缺陷，试考虑一下，如果平末端分子包含有一个或多个BAMHI的识别序列将会发生什么现象呢要是这样，那么切割连杆并产生粘性末端所需要的限制性酶必然对平末端分子进行切割。这样得到的片段确实有正确的粘性末端，但是平末端分子上所包括的基因也被切成碎片，就不是那么让人欣慰的事情了。（5）为了避免这中问题的的发生设计了第二种可以把粘性末端和平端分子连接起来的方法。即使用接头（ADAPTORS）。像连杆一样，接头是一种短的人工合成的寡聚核苷酸，但是与连杆不同的是，合成接头的过程中已经有了一个粘性末端。设计理念当然是要将接头的平末端与DNA片段的平末断连接起来，形成一个带有粘性末端的新分子。（6）这似乎是个简单的方法，但新问题又出现了。单个接头分子的粘性末端能够相互间发生碱基配对形成二聚体。这样新分子仍然是平端分子。用限制性核酸内切酶消化可以再次产生粘性末断，但这违反了最初使用接头的目的。为了回答这一问题需要了解接头分子末断的精细化学结构。一般情况下，多聚核苷酸两端的化学结构是有区别的，通过仔细研究DNA多聚物的结构后，事实就很清楚了。其中一端，即5端有磷酸基团5P，另一端，3端为羟基3OH。在双螺旋内部，双链是反向平行的，这样双链分子的各端都由5磷酸基团和3羟基组成。连接反应一般5磷酸基团和3羟基之间发生。（7）接头是这样合成的平端与正常DNA分子一样。但粘端有所不同，3羟基端依旧，5端磷酸基团有所变更，缺乏磷酸基团，实际上是5羟基。这样DNA连接酶不会在5OH和3OH之间形成磷酸二脂键，结果是尽管接头分子的粘性末端间能够发生碱基配对，但不会发生稳定的连接反应。因此接头能够与DNA分子连接但不会发生自连。（8）接头挂上后，异常的5OH通过多核苷酸激酶可转变为5P，产生的粘性片段可插入到适当的载体中去。第五章将DNA引入活细胞一简答题一、严格地讲，你是怎样理解克隆的克隆的两个主要目的是什么（1）基因操作使我们能够创造出新的DNA重组分子。基因克隆实验的下一个步骤是将这些分子导入活细胞，通常是大肠杆菌。细胞生长分裂，产生克隆。（2）严格地讲，克隆这个字眼仅仅指这一个过程的后一个阶段而不指重组DNA分子本身的构建。13（3）克隆有两个主要目的首先它允许从有限的起始物质中产生大量的重组DNA分子。（4）克隆的第二个重要功能是纯化。产生重组DNA的操作过程中，几乎不能控制到在后期没有其他DNA分子存在的程度。连接混合物中除了目的重组分子外，还包括未连接的载体分子未连接的DNA片段自连载体错误片段插入的重组分子。（5）未连接的分子几乎不会产生什么问题，因为即使他们被细菌细胞摄取，仅在特别的情况下才能复制。而自连载体分子和错误的重组质粒会同目的分子一样有效的复制。因此问题变成了鉴定含正确重组分子。二、就目前基因工程的发展，请你谈谈对转化概念的更深入的理解（1）多数种类的细菌能从其生长的培养基中获取DNA分子，通常以这种方式获取的分子将会被降解，但偶尔会在宿主细胞中生存下来并进行复制。特别是DNA分子是带有能被宿主识别的复制起点的质粒时，这种情况更容易发生。（2）最近转化这个概念有进一步的扩展，它包括任何细胞对任何DNA分子摄取。不管这种摄取是否导致在细胞中产生可察觉的变化，也不管宿主细胞是细菌、真菌还是动植物细胞。三、什么叫感受态它的影响因素有那些（1）所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段，并实现其转化的一种生理状态。（2）它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。（3）CAMP可以使感受态水平提高一万倍，而CA2也可大大促进转化的作用。（4）细胞的感受态一般出现在对数生长期。（5）新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。四、什么叫感受态细胞，以CACL2法为例简述制备感受态细胞实现转化的大概过程（1）在一般情况下，包括大肠杆菌在内的大多数细菌接受DNA的数量是有限的。为了有效地转化这些种类的细胞，细菌必须经历某种形式的理化处理以提高摄取DNA的能力。经历了这种处理的的细胞叫感受态细胞（COMPETENTCELL）。（2）由于重组DNA技术的突破性进展，就转化而言，关键性的进展发生在二十世纪七十年代初。当时发现浸泡在冰冷盐溶液中的大肠杆菌细胞比没有浸泡的细胞摄取DNA的效率更高。（3）制备感受态细胞传统上一般使用50MM的CACL2。尽管其他的盐如氯化铷也有效。（4）当DNA加入到处理过的细胞中，它保持与细胞表面接触，但这是还不能进入细胞质。实际DNA进入感受态细胞的过程还需要42的热激过程，但这种热休克的有效性还没人知晓。五、即使细胞被仔细的制备，感受态细胞的转化的效率也不是很高，那么你如何从数以千14计的没有转化的细胞中，区分出摄取了质粒的转化细胞呢请举例说明答（1）这个问题的回答是充分利用质粒所携带的选择标记。一个选择标记是一个简单的基因，这个基因能提供给转化细胞一种新的性状，这个性状是非转化子不具备的。（2）一个很好的选择标记的例子是PBR322的青霉素的抗性基因。用PBR322进行转化实验后，只有摄取了质粒的大肠杆菌细胞才是AMPRTETR型，能够在含有青霉素或四环素的琼脂培养基上生长。非转化子是AMPSTETS型的，不会在选择培养基上形成菌落，因此就很容易把转化子和非转化子区别开来。六、热休克后为什么转化菌不能立刻涂布到选择培养基上（1）然而要记住的是抗抗生素的特性不仅仅取决于转化细胞中质粒的存在。质粒上的抗性基因必须表达，以合成能够去除抗生素毒性的酶。（2）转化后抗性基因立刻开始表达，但在细胞含有足够的酶以能经得起抗生素的毒性效应前，还需要几分钟的时间。（3）为此，热休克处理后不能马上把转化菌涂布在选择培养基上，而是应该首先放置到不含抗生素的少量液体培养基中进行短期的培养。（4）这时质粒的复制和表达方开始启动，当转化细胞涂皿后遇到抗生素时已经合成了足够的抗性酶而得以生存。七、以使用PBR322作为载体的典型的克隆实验说明插入失活的基本原理（1）对大多数克隆载体而言，DNA片段插入到质粒将会破坏分子上其中某个基因的完整性，因而使重组子得以鉴定，在宿主细胞内，不再出现由失活基因编码的性状。（2）PBR322有几个独一无二的限制性酶切位点用以在插入新DNA片段之前切开载体分子，例如，BAMHI恰恰在编码对四环素有抗性的基因簇内部位置上切割PBR322。（3）一个重组的PBR322，在BAMHI位点内携带额外DNA片段，由于一个必要的基因被插入的DNA破坏，因而就不能给宿主细胞提供对四环素的抗性。含有该重组PBR322分子的细胞，对青霉素有抗性，但对四环素确是敏感AMPRTETS。（4）筛选PBR322重组子以下列方法进行转化后细胞涂布在青霉素培养基上，培养直至长出菌落。所有的菌落都是转化子（未转化细胞对青霉素是敏感的，不会在选择培养基上产生菌落），但是只有很少一部分是重组PBR322分子，大部分包含正常的、自连的质粒。（5）为了鉴别重组子，菌落应该被影印涂布到含有四环素的琼脂培养基上。培养后，一些原来的菌落再生，而另一些没有出现。（6）再生的菌落由没有插入DNA片段正常的PBR322分子的细胞组成，因此有抗四环素的抗性功能AMPRTETR。在四环素琼脂培养基上不生长的菌落是重组子。这个位置曾经是已知的，为了进一步研究，该样品可以从原始琼脂培养基上恢复得到。八、如何用蓝白筛选鉴定PUC系列质粒（1）尽管对抗生素抗性基因的插入失活给重组子的鉴定提供的方便方法，几个重要的15质粒子却采用不同的系统进行筛选鉴定。例如，PUC8携带有氨卞青霉素抗性基因和编码半乳糖苷酶一部分的LACZ基因。（2）用PUC8进行克隆，包括LACZ基因的插入失活，重组子由于不能合成半乳糖苷酶而得以鉴定。（3）半乳糖苷酶是专门将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的一系列酶之一，通常由位于大肠杆菌染色体上的LACZ基因编码。（4）一些大肠杆菌菌株的LACZ基因有了突变，上面缺失了LACZ基因（这个基因能编码半乳糖苷酶的多肽蛋白）。这些突变菌株仅仅在获得携带有缺失的那个LACZ基因片段的质粒（如PUC8）时，才会进行酶的合成。（5）用PUC8进行的克隆实验包括在氨卞青霉素培养基中选择转化子，以及通过筛选半乳糖苷酶的活性来鉴别重组子两个步骤。（6）获取到正常PUC8的细胞是抗青霉素的细胞（AMPR），能够合成半乳糖苷酶；重组子同样能抗青霉素，但不能合成半乳糖苷酶。（7）筛选半乳糖苷酶是否存在实际上很容易。这需要一种称为XGAL的物质（一种乳糖类似物），该物质能够被半乳糖苷酶分解成深兰色的产物。如果我们将XGAL和乳糖诱导物（如IPTG）同时加到含有青霉素的琼脂培养基中，非重组子能够合成酶的细胞，将染成兰色。然而重组子（LACZ基因被破坏了）不能产生半乳糖苷酶，将是白色的。这个筛选系统称为“蓝白筛选”或“LACSELECTION”。第六章大肠杆菌克隆载体为了了解分子生物学家所用的载体的范围，现在我们必须要仔细地研究克隆载体本身，了解各种载体的特性和用途。用于大肠杆菌为宿主的克隆载体存在最为广泛。一、基于大肠杆菌质粒的克隆载体。最早发展起来的，也是目前最受欢迎的载体之一就是PBR322，在第五章我们对该载体进行了介绍，说明了转化子的筛选和重组子的鉴定。下面我们通过更仔细地研究PBR322，来研究大肠杆菌的质粒克隆载体。二、举例说明质粒克隆载体是如何命名的（1）以PBR322为例，PBR322的名字符合载体命名的标准规则。（2）P代表PBR322就是一种质粒。（3）BR表示最初构建该载体的实验室BR代表BOLIVAR和RODRIGUEZ,发展该质粒的两个研究者（4）322用于将该质粒和在同一个实验室发展起来的其他质粒区分开来。也有称为PBR325,PBR327,PBR328的质粒三、PBR322有那些有用的特性（有那些优势）（1）PBR322的遗传和物理图谱指出了为什么该种载体是如此受到欢迎的克隆载体。16（2）在第2章中我们陈述了，克隆载体的大小应该小于10KB，以避免在纯化过程中出现的诸如DNA断裂等问题。PBR322的大小为4363KB，这就意味着不仅载体本身易于纯化，而且可以用它构建重组DNA分子。即使携带6KB额外DNA片段，重组PBR322分子仍然可以进行基因操作。（3）PBR322的第二个特性是（正如第5章描述的那样）携带两套抗生素抗性基因。不管氨卞青霉素抗性基因，还是四环素抗性基因都为包含该质粒的细胞提供可使用的选择标记。每一个标记基因都包括可用于克隆实验的独一无二的限制性酶切位点。（4）经过PSTI、PVUI或SCAI酶切使新的DNA插入到PBR322中，会使AMPR基因失活。使用8个限制性核酸内切酶著名的如BAMHI和HINDIII任何一个插入新的DNA片段，将使四环素抗性基因失活。就意味着可用带有一系列粘性末段的任何一个克隆DNA片段插入失活这些众多的限制性位点。（5）第3个优点是PBR322有比较高的拷贝数目。一般转化的大肠杆菌细胞有15个分子存在。但是可以通过加入蛋白质合成抑制剂（氯霉素）进行质粒的扩增使拷贝数达到10003000个。因此大肠杆菌培养物可以提供高产的重组PBR322分子。四、PBR322作为一个克隆载体使用起来十分方便，那么该载体是如何构建的呢（1）作为克隆载体PBR322的显著的便利不是随机产生的，质粒经过精心的构建最后才有了理想性能。（2）事实上PBR322由来自天然存在的三种不同的质粒组成。氨卞青霉素抗性基因最初位于R1质粒上，这种R1质粒是一种典型的抗生素抗性质粒，发生于天然的大肠杆菌群落中。（3）四环素抗性基因来源于R65质粒，第2个抗生素抗性质粒。（4）PBR322的复制起点，能使该载体在宿主细胞中复制，最初来自于PMB1（一种与产大肠杆菌素质粒COLE1密切相关的质粒）五、PUC8是如何演变而来的，为什么说它是最受欢迎的大肠杆菌克隆载体（1）PUC8是一种能进行LAC筛选的种质粒。（2）PUC8衍生于PBR322，尽管仅保留了复制起点和抗氨卞青霉素基因。氨卞青霉素抗性基因有所改变，不再包含单一的限制性酶切位点，所有的克隆位点都集中在由该质粒携带的LACZ基因的短片段上。（3）PUC8有三个重要的优势以使其成为最受欢迎的大肠杆菌克隆载体之一。第一个优势是偶然发生的，在PUC8载体构建的过程中，复制起点内部的一个随机的突变使基因操作得以完成，甚至在扩增之前，就导致PUC8载体含有500700个拷贝数。从而对来自于带有PUC8重组质粒的转化细胞所克隆DNA产量产生极大的影响。（4）第2个优势是重组细胞的鉴定可以一步完成，即将重组细胞涂布在含有氨卞青霉素加XGAL的琼脂板上即可。对于PBR322重组子的筛选却要经过两个过程，需要从一个抗性培养基上影印涂布到另一个培养基上面，因此用PUC8进行克隆实验比用PBR322的17实验节省一半时间。（5）PUC8的第3个优点是限制性内切酶的酶切为点集中一起，允许一个带有两个粘性末端（一端是ECORI的，另一端是BAMHI的）DNA片段不借助额外操作（例如加上LINKER）就可被克隆。（6）其他的PUC载体携带不同组成的限制性位点，可为不同类型的需要克隆的DNA提供更大的灵活性。另外，这些载体上集中排列的限制性位点和M13MP系列载体的排列是相同的。克隆在PUC系列载体上的DNA可以通过测序和体外突变加以分析。六、结合噬菌体的基因组成，谈谈在构建噬菌体克隆载体时存在那些问题但为什么人们还是要想方设法地去构建呢它有那些吸引人的地方（1）通过研究M13可以了解到构建一个噬菌体克隆载体存在一些问题。正常的M13基因组大小为64KB，但其大部分由紧紧挤在一起的十个基因组成。每个基因对噬菌体的复制是必须的。仅有一个由507个核苷酸组成的间隔序列IS序列可以被DNA插入而不破坏这些基因。另外这一区域还包括复制起点，本身必须保持完好。显然这唯一有限的空间可用于更改M13基因组。（3）然而要知道M13最大的吸引力是它可以提供克隆DNA的单链副本。这个特性极大地刺激了M13克隆载体的发展。七、简述M13MP2的构建过程（1）构建一个M13克隆载体的第一步是将LACZ基因引入到间隔序列IS中，这样就产生了在XGAL琼脂板上能产生兰色噬菌斑的M13MP1。（2）M13MP1载体在LACZ基因上不具有任何单一酶切位点，然而它在基因的起始位置附近包含一个六核苷酸序列，即GGATTC。这里单一核苷酸的更改就可以变为GAATTC，即ECORI的限制位点。使用体外突变的方法就可以进行更改，从而产生了M13MP2。（3）M13MP2载体上的LACZ基因稍有变动，现在第六个密码子专门编码天冬酰胺而非天冬氨酸了，但是由M13MP2侵染的细胞产生的半乳糖苷酶的活性依然保持完好。（4）M13MP2是最简单的M13克隆载体，带有ECORI粘性末端