浙大远程教育2013-康复护理学甲作业

银杏叶多糖的提取与含量测定摘要以干燥的银杏叶为原料，采用水提醇沉法提取其中的活性物质银杏叶多糖，并测定其含量。通过单因素实验研究了乙醇沉淀浓度、乙醇用量和沉淀次数对银杏叶提取纯化率的影响，从而确定了提取银杏叶多糖的优化条件为料液比130，浸提温度80，浸提时间3H，浸提次数2次，在浸提液真空浓缩至原来体积30，用15倍体积无水乙醇沉淀2次，干燥，洗涤，银杏叶多糖得率为4925。关键词银杏叶多糖；单因素试验；提取纯化；含量测定ABSTRACTCHOOSINGDRIEDGINKGOLEAVESASRAWMATERIALWEUSEDTHEMETHODOFWATEREXTRACTIONANDALCOHOLPRECIPITATIONTOEXTRACTTHEACTIVESUBSTANCETHEPOLYSACCHARIDESOFGINKGOLEAF,ANDDETERMINEDTHECONTENTOFITUSINGSINGLEFACTOREXPERIMENTALMETHOD,WESTUDIEDTHEIMPACTSOFALCOHOLPRECIPITATIONCONCENTRATION,ALCOHOLDOSAGEANDPRECIPITATIONTIMESONTHEPURITYOFEXTRACTION,ANDCONCLUDEDTHATTHEOPTIMALCONDITIONTOEXTRACTPOLYSACCHARIDESISMATERIALLIQUIDRATIO130EXTRACTIONTEMPERATURE80,EXTRACTIONTIME3HOURS,EXTRACTIONTIMESTWICEWHENEXTRACTIONSOLUTIONVACUUMCONCENTRATEDTO30OFTHEORIGINALVOLUME,USE15TIMESTHEVOLUMEOFTHEABSOLUTEALCOHOLTOPRECIPITATETWICE,ANDTHEN,WASH,DRY,THEYIELDOFPOLYSACCHARIDESREACHED4925KEYWORDSPOLYSACCHARIDESINGLEFACTOREXPERIMENTEXTRACTION1引言近几十年来,人们发现糖类在生物体中不仅是作为能量资源或结构材料,更重要的是它参与了生命科学中细胞的各种活动,具有多种多样的生物学功能。到目前为止,已有近300种的多糖类化合物从天然产物中被分离提取出来。其中,从植物中尤其是从中药中提取的水溶性多糖最为重要。这些活性多糖的生理活性、化学结构以及工艺提取条件成为多糖研究的前沿阵地,取得了很大的进步13。银杏树为我国特产,有活化石之称,有着丰富的药用价值,其叶、果和外种皮等皆具有药用开发价值4。目前对银杏多糖的研究主要集中于银杏叶和银杏外种皮中提取的银杏多糖的药用价值5，已经有很多实验证实银杏叶多糖有生理活性促进作用。安徽省淮南师范学院陈群、刘天骄的研究结果表明银杏叶多糖GBLP对小鼠S180实体瘤、腹水瘤的生长有抑制作用和对荷瘤小鼠免疫调节作用,表明GBLP具有较强的免疫调节活性和抗肿瘤作用6。费瑞,徐冬梅,温得中等研究得出银杏叶多糖对人脐静脉内皮细胞与HL60细胞粘附有影响作用7。侯华新、黎丹戎等研究发现银杏叶多糖可增加化疗药物对鼻咽癌细胞、宫颈癌细胞的治疗敏感性,是一种有希望的放射增敏剂8。陈有福,李永强,韩毳,等研究证明中药银杏叶提取物在精神科有广泛应用9。同样有许多研究者在银杏叶多糖提取、分离、纯化以及含量测定上有显著成绩1018。银杏叶多糖提取方法的优化为进一步在理论上证实银杏叶多糖的多种活性功能提供支持,同时也为中药现代化的研究开辟道路。对于进行银杏叶多糖的产业用途也有一定的借鉴意义。本文采用水提醇沉提取银杏叶多糖,并用单因素试验法对提取工艺进行了优化,为银杏叶多糖的进一步深入开发利用打下基础。2实验器材的准备A实验所需试剂无水乙醇、95乙醇、90乙醇、85乙醇、80乙醇、苯酚、硫酸（80）、葡萄糖标准溶液、双蒸水B实验用具烧杯、蒸发皿、试管、玻璃棒、量筒、移液管、容量瓶C实验设备紫外分光光度计、恒温干燥箱、粉碎机、水浴锅、离心机、冰箱、水浴锅3实验过程31实验的基本步骤提取、纯化方法银杏叶多糖提取、纯化步骤A银杏叶处理实验前用70恒温干燥箱将银杏叶再烘1次B恒温提取按130固液比加水，在恒温水浴中恒温提取。C离心提取后用离心机以5000R/MIN离心20MIN，收集上清液，残渣同前再提取1次，合并两次上清液。D浓缩用真空干燥箱对纯化后的离心液进行浓缩。E醇沉淀加入一定量的一定浓度的乙醇，放入冰箱静置一定时间F离心对醇沉的白色絮状多糖沉淀进行离心。G洗涤得到的多糖用无水乙醇清洗后放入小烧杯中，在水浴锅中蒸干后，放入80烘箱中干燥。32标准曲线的建立多糖含量测定采用苯酚硫酸法，以葡萄糖为标准样品。精确称取01G葡萄糖，用蒸馏水定容至100ML容量瓶中，摇匀备用。吸取上述1MG/ML的葡萄糖溶液000、100、200、300、400、500、600分别用蒸馏水稀释至50ML容量瓶中，得到不同浓度的葡萄糖标准溶液。从各个瓶中准确移取200ML，置于25ML具塞比色管中，加入5苯酚溶液100ML，摇匀，迅速加入浓硫酸500ML，静置5MIN后，置于沸水浴加热15MIN，冷却至室温，用分光光度计在490NM处测定吸光度，制作标准曲线。33单因素实验331醇浓度的影响称取已粉碎的银杏新叶5G5份，分别加入锥形瓶中，各加入150ML蒸馏水，并分别编号15号，于80水浴中浸提3H。取出离心，取上清液，残渣同前再浸提一次，取出离心，合并两次上清液。上清液在60下浓缩成30的体积，分别加3倍体积的无水乙醇、95乙醇、90乙醇、85乙醇、80乙醇，置冰箱中沉淀24H。再次离心，取沉淀，用85、95和无水乙醇反复洗涤，干燥，按标准曲线绘制项下方法测定其吸光度并计算多糖含量。332醇沉淀次数的影响称取已粉碎的银杏新叶5G3份，分别加入锥形瓶中，各加入150ML蒸馏水，并分别编号13号，于80水浴中浸提3H。取出离心，取上清液，残渣同前再浸提一次，取出离心，合并两次上清液。上清液在60下浓缩成30的体积。1号中加入3倍体积无水乙醇；2号中加入15倍体积无水乙醇，沉淀12H后，离心，取沉淀，上清液再加入15倍体积无水乙醇，沉淀12H；3号中加入1倍体积无水乙醇，沉淀8H后，离心，取沉淀，上清液再加入1倍体积无水乙醇，沉淀8H后，离心，取沉淀，上清液再加入1倍体积无水乙醇，沉淀8H。再次离心，取沉淀并合并，用85、95和无水乙醇反复洗涤，干燥，按标准曲线绘制项下方法测定其吸光度并计算多糖含量。333新叶与落叶的比较称取已粉碎的银杏新叶5G2份，银杏落叶5G2份，分别加入锥形瓶中，各加入150ML蒸馏水，并分别编号14号，于80水浴中浸提3H，取出离心，取上清液，残渣同前再浸提一次，取出离心，合并两次上清液。上清液在60下浓缩成30的体积。加15倍体积的无水乙醇，醇沉12H，离心，取沉淀，上清液再加入15倍体积无水乙醇，沉淀12H。再次离心，合并两次沉淀，用85、95和无水乙醇反复洗涤，干燥，按标准曲线绘制项下方法测定其吸光度并计算多糖含量。4结果与讨论41葡萄糖标准曲线图表1葡萄糖标准曲线表0050005010150202503葡萄糖标准曲线0000100020003000400050006001300890122019402060213Y00404X00419R209435CMG/MLA620NM图1葡萄糖标准曲线图由葡萄糖标准曲线可以看出，在490NM处的吸光度值随着葡萄糖浓度的增加而线性增加，线性方程为Y0040X00419。由此，我们可以根据葡萄糖标准曲线图而推断出银杏叶多糖的含量。42影响银杏叶多糖提取的单因素实验421不同乙醇沉淀浓度对银杏多糖的率的影响组数（A）12345银杏新叶（G）55555C（MG/ML）0000100020003000400050006A620NM0001300890122019402060213乙醇浓度无水乙醇95乙醇90乙醇85乙醇80乙醇乙醇沉淀次数1（1次）1（1次）1（1次）1（1次）1（1次）银杏多糖得率（）49214056401939423600图2醇沉淀浓度对银杏多糖的影响不同乙醇沉淀浓度对银杏多糖的率的影响见图2，由图2可看出银杏多糖的得率随着乙醇浓度的降低而减少，当乙醇沉淀浓度从无水乙醇到95乙醇时，多糖得率从4921减少到4056，多糖得率减少了0865，这可能是因为乙醇浓度的突然降低，小部分多糖溶于水未达到饱和状态而没有析出，因此导致多糖得率显著降低。当乙醇沉淀浓度从95乙醇到80乙醇时，多糖得率从4056到3600，多糖得率减少了0456，这可能是因为此时多糖的析出因乙醇浓度的逐步降低达到了一个稳定而平衡的状态，因此多糖得率下降不显著。最终可以得出，最佳的乙醇沉淀浓度为无水乙醇。422不同乙醇沉淀次数对多糖得率的影响组数（B）123银杏新叶（G）555乙醇浓度无水乙醇无水乙醇无水乙醇乙醇用量（ML）3倍体积15倍体积1倍体积乙醇沉淀次数1（1次）2（2次）3（3次）银杏多糖得率（）443649294800图3乙醇沉淀次数对多糖得率的影响由图3可知，不同乙醇沉淀次数对多糖得率有显著的影响。用3倍体积的无水乙醇1次沉淀和2次沉淀相比，沉淀2次的银杏多糖得率比沉淀1次要高出0493，这是因为沉淀1次时，溶液中银杏多糖的物质量浓度为1/4V，而沉淀2次时，溶液中银杏多糖的物质量浓度为1/2V2V（假设溶液中银杏多糖的物质的量为1），由此可知，沉淀1次析出的银杏多糖比沉淀2次少。由此推断，沉淀3次析出的银杏多糖应该比沉淀2次高，但是，沉淀3次时的银杏多糖得率却比沉淀2次减少了0129，这可能是因为沉淀次数太多而导致了银杏多糖在离心，取出等过程中损失增大，从而使得银杏多糖得率减少。综上分析，可得出最佳沉淀次数为2次。423银杏落叶与新叶多糖含量比较组数（C）重量（G）乙醇浓度沉淀次数得率银杏新叶15无水乙醇2（2次）4961银杏新叶25无水乙醇2（2次）4889银杏落叶15无水乙醇2（2次）4450银杏落叶25无水乙醇2（2次）4402图4银杏落叶与新叶中多糖含量的比较由图4可知，银杏新叶1、2组的银杏多糖得率分别为4961、4889，取其平均值可求得银杏新叶中多糖含量为4925。银杏落叶1、2组的银杏多糖得率为4450、4402，取其平均值可求得银杏落叶中多糖含量为4426。因此，银杏新叶中的银杏多糖含量比银杏落叶中的银杏多糖含量高。这是因为，一方面银杏叶在凋落后，细胞没有完全死亡，消耗了叶中的多糖；另一方面，银杏叶在凋落之前，多糖可能发生了部分转移，导致银杏落叶中银杏多糖含量减少。5结论银杏是冰川时期存活在地球上的孑遗植物，素有“活化石”之称。中国是银杏的发源地，其资源占世界总量的70左右。很多研究表明银杏叶中的活性物质多糖，具有抗肿瘤、抗病毒、增强免疫力、延缓衰老、降血脂、降血糖、解毒、抗辐射等功效，而且目前，银杏叶制剂已从单纯的药用逐步应用到食品饮料、保健品等行业，含银杏叶提取物的护发、生发、护肤等化妆品的开发也取得一定的进展。本实验采用单因素试验对影响银杏叶多糖提取条件进行了探讨，筛选出了最佳提取条件为醇沉淀浓度为无水乙醇，沉淀次数为两次，与前人提取,银杏叶多糖的工艺相比，水煮醇提法提取率更高，实验简单且所需时间短，具有很高的生产利用价值，为衡阳地区对银杏叶多糖的开发与利用提供了良好的依据。与此同时，实验测得银杏落叶的多糖含量为4426，新叶多糖含量为4925，由此可知，衡阳地区的银杏落叶多糖含量比新叶低，但相差不大。因此，利用提取落叶中的银杏多糖来大量生产银杏多糖药物、保健品等产品，既实现了“绿色生产”和“低成本，高收益”的宗旨，达到“绿色产品”和“废物利用与资源回收”的标准，又保护了世界孑遗物种银杏不受破坏。6参考文献1黄桂宽,曹麒燕银杏叶多糖的化学研究J中草药,1997,082李开泉,陈武,熊筱娟,等银杏叶的化学研究J江西中医学院学报,2002,141613池静端,徐礼焱木,马辰,等银杏叶的化学成分研究J中国中药杂志,1997,2221064梁淑轩,孙汉文银杏叶资源开发利用研究进展J河北大学学报自然科学版,2003,2322045姚碧文,陈伟银杏叶药理研究进展J浙江中西医结合杂志,2005,1531926陈群,陈永红银杏叶多糖的分离、分析及其对小鼠腹腔吞噬细胞的影响J淮南师范学院学报,2002,027费瑞,徐冬梅,温得中,等银杏叶多糖对人脐静脉内皮细胞与HL60细胞粘附的影响J东北师大学报自然科学版,2005,048侯华新,黎丹戎,黄桂宽,等银杏叶多糖在肿瘤放射、化学治疗中的增敏作用研究J广西医科大学学报,2005,019陈有福,李永强,韩毳,等中药银杏叶提取物在精神科的应用J中国民康医学杂志,2004,1629410夏秀华,王海鸥银杏叶多糖提取工艺研究J食品研究与开发,2006,0111姜波,王艳颖,刘长建,等银杏叶多糖提取、纯化及其含量的测定J时珍国医国药,2007,1112杨静峰,张旭,梁忠岩,等银杏叶水溶性多糖的分离、纯化、初步鉴定及活性研究J特产研究,2006,0413王敏,吕凤霞,陆兆新,等银杏叶多糖提取及超滤工艺的研究J中国中药杂志,2007,1514王奎兰,黎碧娜,叶凯贞,等银杏叶中有效成分的提取及其应用J日用化学工业,2004,34317015植松大辅，刘芳，陈谅，等银杏叶提取物J日本医学介绍,200