基因工程问答题整理

名解抗体B细胞在抗原的刺激下分化为浆细胞，产生具有与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白，称为抗体。FAB用木瓜蛋白酶将IGG分子断裂的3个大小相似的片段中能与抗原结合的2个片段FC用木瓜蛋白酶将IGG分子断裂的3个大小相似的片段中不能与抗原结合的1个片段免疫球蛋白具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白。超变区重链和轻链的V区各有三个区域的氨基酸组成和排列顺序特别易变化，称为超变区可变区重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，称为可变区单克隆抗体由一个克隆细胞产生、只作用于某一抗原决定基的均一抗体。借助小鼠B细胞杂交瘤技术，所制备的高度均一（属同一类、亚类、型别）、单一特异性（仅针对特定抗定抗原表位）的抗体ADCC抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，表达FC受体的细胞通过识别抗体的FC段直接杀伤呗抗体包被的靶细胞。调理作用抗体，补体等调理素促进吞噬细胞吞噬细菌等颗粒性抗原的作用J链一条由浆细胞合成的富含半胱氨酸的多肽链，可连接IG单体形成的二聚体，五聚体或多聚体分泌片分泌型IGA的一个辅助成分，由粘膜上皮合成，连接IGA二聚体上，使其成为分泌型，保护其铰链区免受蛋白水解酶作用，介导其转运到粘膜表面IG功能区IG分子的每条肽链可折叠为几个功能不同，结构相似的球形功能区，或称结构域IG折叠由几股多肽链折叠形成的2个反向平行的片层结构，2个片层结构中心的2个半胱氨酸残基由一个链内2硫键垂直连接，可稳定结构域，形成一个桶状结构，这种折叠方式称为免疫球蛋白折叠。CDR互补性决定区，即高变区（超变区）IG免疫球蛋白同种型同一种属内所有个体共有的IG抗原特异性标记同种异型同一种属不同个体间IG分子所具有的不同抗原特异性标志。由若干散在分布的氨基酸序列差异导致。独特型每一个IG分子在CDR区氨基酸序列所显示出的免疫性，是每一个IG分子所特有的抗原特异性标志。多克隆抗体用含多种抗原决定簇的抗原物质免疫动物，刺激多个B细胞克隆所获得的免疫血清（含多种抗体的混合物），此为多克隆抗体单克隆抗体同7基因工程抗体根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。嵌合抗体人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。改型抗体CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。表面重置对鼠CDR及FR表面残基进行镶饰或重塑，使之类似于人抗体CDR的轮廓或人FR的形式补偿交换在人FR中选择与CDR有相互作用，与抗体的亲和力有密切关系或对FR空间结构折叠起关键作用的残基进行改变，以补偿完全的CDR移植镶面抗体以抗体为参照改造替换鼠源单抗的表面氨基酸残基得到的抗体单链抗体用一编码亲水易折叠多肽的人工合成寡核苷酸，将重链V区（3）与轻链V区（5）端连接在一起即成单链抗体基因，将此基因克隆入原核或真核表达载体中，在原核或真核系统中表达出的蛋白质即为单链抗体双特异型抗体能同时识别2种抗原的抗体。1种为对应肿瘤相关抗原。另1种为对应效应成分。即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞,小分子抗体包括FAB、FV或SCFV、单域抗体及最小识别单位等几种分子量较小的抗体片段。单链抗体见27最小识别单位约为完整分子的1/801/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性，是比单域抗体更小的分子，仍能与抗原结合，只是亲和力相当低噬斑印迹将菌落或噬菌斑直接转移到滤膜上，使溶菌抗体暴露，同标记抗原杂交进行杂交检测，杂后根据杂交信号及其相对应的菌落或噬菌斑的位置，杂交便可从大量菌落或噬菌斑中筛选出含有目的基因的噬菌斑。质粒展示技术是以“蛋白DNA复合物”形成为基础，将随机多肽与DNA结合蛋白以融合蛋白的形式表达，通过筛选可以得到目的蛋白及其编码基因序列，融合蛋白在相对还原的ECOLI菌的细胞质内表达和折叠，体内融合蛋白结合于编码质粒的DNA序列上，从而实现目的蛋白“表型基因型”的结合。疫苗是一类接种后能激发人体免疫反应来抵抗某些传染病的生物制品灭活疫苗灭活疫苗又称死疫苗，是指利用加热或甲醛等理化方法将人工大量培养的完整的病原微生物杀死，使其丧失感染性和毒性而保持其免疫原性，并结合相应的佐剂而制成的疫苗。弱毒疫苗减毒活疫苗又称弱毒疫苗，是指将微生物的自然强毒株通过物理、化学和生物学的方法，连续传代，使其对原宿主丧失致病力，或只引起亚临床感染，但仍保持良好的免疫原性、遗传特性，用这种毒株制备的疫苗就叫减毒活疫苗。合成多肽疫苗合成肽疫苗是指使用化学方法合成能够诱发机体产生免疫保护的多肽制成的疫苗。亚单位疫苗亚单位疫苗是指提取或合成细菌、病毒外壳的特殊蛋白结构，即抗原决定簇制成的疫苗，这类疫苗不是完整的病毒，是病毒的一部分物质，故称亚单位疫苗。基因缺失疫苗使用分子生物学技术去除与毒力有关的基因获得的缺失突变毒株制成的疫苗重组活载体疫苗基因工程载体疫苗是指利用微生物做载体，将保护性抗原基因重组到微生物体中，使用能表达保护性抗原基因的重组微生物制成的疫苗。核酸疫苗指使用能够表达抗原的基因本身，即核酸制成的疫苗。定向突变采用随机的基因突变或基因重组技术与定向的突变体筛选方法相结合得到分子进化技术，包括制备突变体文库，突变体文库在适当的表达系统内表达，筛选突变体盒式诱变将靶基因的一段DNA删掉，并用人工化学合成所具有的突变核苷酸的双链寡核苷酸片段取代一、名词解释1基因基因有遗传效应的DNA片段，是控制生物性状的基本遗传单位2基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品3操纵子4何谓接头连接法5质粒能自主复制的染色体外DNA分子，为双链环状，广泛存在于细菌及某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中。6限制性核酸内切酶可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶7PCR聚合酶链式反应8RTPCR9CDNA文库以MRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成CDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段CDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部MRNA信息的CDNA克隆集合称为该组织细胞的CDNA文库。10报告基因载体分子上有一种特殊意义的基因序列，它们表达的目的是为了证明载体已经进入宿主细胞，并将含有外源基因的宿主细胞从其他细胞中区分并挑选出来。这种基因就是报告基因。11载体具备自我复制能力的DNA分子。12克隆载体可携带插入的外源DNA片段并可转入受体细胞中大量扩增的DNA分子。该分子中含有能够在受体细胞中自主复制的序列和筛选标记，常用于外源基因的克隆，如噬菌体或质粒。13表达载体在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。14转化某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。15转染真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。16质粒载体在由限制性核酸内切酶修饰过的质粒DNA序列中插入外源的目的基因，以质粒为载体，将目的基因通过转化或转导的方法导进宿主细胞，进行重组、筛选、扩增的过程。18粘性末端当一种限制性内切酶在一个特异性的碱基序列处切断DNA时，就可在切口处留下几个未配对的核苷酸片段，即5突出。这些片断可以通过重叠的5末端形成的氢键相连，或者通过分子内反应环化。因此称这些片段具有粘性，叫做粘性末端。19启动子启动子是位于结构基因5端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。20增强子增强子ENHANCER指增加同它连锁的基因转录频率的DNA序列21选择标记22病毒载体（噬菌体）23亲和层析是一种吸附层析，依赖于蛋白质和它的配体（LIGAND）之间的相互作用来分离的。24包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。25核糖体结合位点是细胞MRNA的一个序列，它包括蛋白质合成起始期被30S亚基结合的一个起始密码子。26菌落原位杂交27SOUTHERN印迹杂交28WESTERN印迹WESTERN免疫印迹（WESTERNBLOT）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测29核酸分子杂交核酸分子杂交（简称杂交，HYBRIDIZATION）是核酸研究中一项最基本的实验技术。互补的核苷酸序列通过WALSONCRICK碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。30转化子转化后的受体菌，称转化子31融合蛋白32选择标记33整合表达系统基因整合到基因组中发生的表达。34瞬时表达系统外源基因进入受体细胞后，未整合进受体细胞基因组而立即转录，出现基因产物。35融合标签融合标签技术是20世纪末兴起的一种基因重组技术，其主要过程是利用重组DNA技术在靶蛋白编码基因的3端或5端融合某种标签的编码基因，通过适宜的宿主来表达重组蛋白质，表达的重组蛋白质可以通过融合的标签与包被在固相基质上的特异配基结合而进行纯化。36抗生素表型法由于载体含有抗性基因，当转化后宿主细胞即获得该抗性基因的特性，因而可以在涂有该抗生素的培养基上可以生长。否则，不能生长。37插入失活法若把外源DNA片段插入到载体的选择标记基因中而使此基因失活，丧失其原有的表性特征，此方法叫插入失活。标记基因多为抗生素抗性基因。38插入表达法39蓝白筛选法蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法是根据载体的遗传特征筛选重组子，如互补、抗生素基因等40KLENOW片段KLENOW片段，又名DNA聚合酶I大片段（克列诺片段，KLENOWFRAGMENT，或称克列诺酶，KLENOWENZYME）ECOLIDNA聚合酶经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。该片段保留了DNA聚合酶I的53聚合酶和35外切酶活性，但缺少完整酶的53外切酶活性。41T4DNA连接酶编号EC6511。来自感染T4噬菌体的大肠杆菌，催化双链DNA平头末端或黏性末端相邻核酸的5PO4和3OH连接反应的酶，还可催化双链RNA和双链RNA或DNA连接，但不能催化单链核酸的连接。可修补在双链DNA、RNA或DNA/RNA杂种分子中的单链切口。42STREP标签43FLAG标签44钙调蛋白结合肽简答题RACE技术的原理（已有）CDNA末端快速扩增RAPIDAMPLIFICATIONOFCDNAENDS,RACE技术是一种基于MRNA反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得MRNACDNA完整序列的方法。如何构建改性抗体答抗体的抗原结合区域（V）与空间结构主要由抗体V区中3个CDRS（互补决定区）所决定，所以这一抗体的构建是用原鼠IGV区中的CDR区插入到人IGV的框架区。为了构建这类抗体，首先需要测出MABV区的核苷酸序列，根据其中的CDRS序列，用全合成或点突变的方法将人IG重构成MABV区的CDRS序列，然后将这种重构的V区基因与人IGC区基因连接，构成完整的人IG基因，再于骨髓瘤细胞内表达。方法模板替换同源FR表面重塑人CDR、FR轮廓补偿替换在人FR中选择残基进行变换表面展示重链10个，轻链4个原则维持原抗体构像同源序列框架区影响抗原结合氨基酸CDR两侧的框架区序列N末端序列3简述免疫球蛋白的结构功能区及作用具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白。可变区识别并特异性结合抗原恒定区1激活补体系统2结合FC受体3穿过胎盘与粘膜（不具体）4简述单克隆抗体基本原理5木过蛋白酶和胃蛋白酶水解片段有何异同1木瓜蛋白酶水解FABFC2胃蛋白酶F（AB）2PFC由一个克隆细胞产生、只作用于某一抗原决定基的均一抗体6激活补体的能力IGM大于IGGIGM为五聚体，IGG为单体，M比G多一个功能区CH47比较单抗与多抗单克隆和多克隆抗体的比较和用途特异性敏感性均一性MCABPCAB低差无高强有1、用于免疫学检测，辅助临床诊断2、MCAB用于亲和层析，分离微量可溶性抗原3、标记的MCAB用于基础研究，了解细胞分化等4、制备生物导弹用于肿瘤、移植等的临床治疗8如何构建单链抗体用一编码亲水易折叠多肽的人工合成寡核苷酸，将重链V区（3）与轻链V区（5）端连接在一起（VHLINKERVL）即成单链抗体基因，将此基因克隆入原核或真核表达载体中，在原核或真核系统中表达出的蛋白质即为单链抗体（SINGLECHAINANTIBODIES）9如何构建单链抗体抗体库噬菌体表达小分子抗体建立噬菌体抗体库SCFVABFVD固相化抗原吸附洗脱扩增噬菌体抗体库噬菌体抗体库10噬菌体表面展示技术噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。核糖体展示技术将正确折叠的蛋白及其MRNA同时结合在核糖体上，形成MRNA核糖体蛋白质三聚体，使目的蛋白的基因型和表型联系起来，可用于抗体及蛋白质文库选择、蛋白质体外改造等。11如何利用细菌战士技术筛选高亲和力抗体外源蛋白与载体蛋白结合方式C端融合N端锚定在外膜N端融合C端锚定在外膜夹心融合有些蛋白本身具有信号肽序列及锚定于外膜的序列，内部合适位点插入外源蛋白亲和筛选分为固相筛选和液相筛选，主要有ELISA和磁珠法。HANES等认为,ELISA方法中，抗原包被在塑料表面上，而塑料表面的疏水作用有可能会影响吸附蛋白的空间构象，从而导致筛选出的抗体分子不能识别抗原的天然表位磁珠法是在抗原上连接捕获标签，如生物素，然后在形成抗原抗体复合物后,采用磁珠链霉亲和素捕获该标签,进行亲和筛选。12基因工程疫苗的优点及缺点和研发方向GENEGINERINGVACINEETICENGIERINGVACINEDNA1GENENGIERINGSUBNITVACINEADJUVANT2GENEENGINEERINGVECTORVACCINE3NUCLEIACIDVACINEGEVACINE一种或多种抗原编码基因克隆到真核表达载体上，将构建的重组质粒直接注入到体内而激活机体免疫系统。优点1抗原合成和递呈过程与病原的自然感染相似，这是灭活疫苗和亚单位疫苗不能比拟的。2便于制备多价疫苗。3引起广泛的细胞免疫和体液免疫。4避免了病毒本身毒力返租和整合到宿主染色体。5易于构建和制备，稳定性好6成本低廉，适于规模化生产。缺点1被注射的、可由宿主吸收的DNA有可能被整合到宿主的染色体中，并引起插入突变。尽管这种概率很低；2外源抗原的长期表达可能导致不利的免疫病理反应；3使用编码细胞因子或协同刺激分子的基因可能具有额外的危害；4有可能形成针对注射DNA的抗体和出现不利的自身免疫紊乱；5所表达的抗原可能产生意外的生物活性。解决这些安全问题是研究核酸疫苗的焦点。研发方向急需研制的基因工程病毒疫苗急需研制的基因工程病毒疫苗主要有十几种值得使用基因工程技术进行改造的传统病毒疫苗病毒基因工程疫苗主要集中在研制常规技术不能或很难解决的新疫苗和改造免疫保护效果差，负反应较大，或成本较高，或使用不方便的传统疫苗上，有的疫苗兼有预防和治疗两种功能3AIDSHIV（2）研制方向使用含前S（主要是前SI）的新一代乙肝基因工程疫苗，可使对现有S乙肝疫苗无反应的人群产生良好的免疫反应。目前，含前S的疫苗，新佐剂乙肝疫苗，乙肝抗原抗体复合物疫苗，治疗性乙肝研究的热点。研究方向；使用病毒外膜蛋白E1E2研制病毒样颗粒的亚单位疫苗使用载体进行重组活疫苗研究。由于丙肝病毒变异快，极易冲破已有中和抗体的屏障，选择变异不大且能诱发细胞免疫的抗原是目前研究的重要的方向之一。目前研制的高度减毒的非复制型载体是研制该疫苗的重要途径；制备减毒活疫苗是RSV疫苗研制的另一个重要途径，负链RNA病毒CDNA转染技术的成功给使用现代分子生物学技术制备RSV的分子减毒活疫苗带来了希望，也是目前RSV疫苗研制重要途径。目前使用分子生物学技术，有目的地去除与与毒力、潜伏及肿瘤相关基因的分子减毒疫苗株正在研制中。基因工程技术表达的GB做亚单位疫苗或重组活疫苗的研究已成为目前HMV疫苗研究的一个重要方向。病毒糖蛋白GD和GB是主要的保护性抗原，与GC、GE、GI联合使用可诱生体液和细胞免疫，在动物实验中，HSVIIGD的核酸疫苗可以保护动物免受感染及随后的潜伏感染，这些研究为单纯疱疹病毒疫苗的研究提供了有力的证据。通过表达PRME形成病毒样颗粒的亚单位疫苗显示了较好安全性和免疫保护性，是该疫苗研究的重要方向。使用该病毒感染性CDNA进行的分子减毒活疫及多种亚型嵌合的减毒活疫苗研究也取得了较好效果，是另一个重要途径。13什么是定向进化技术采用随机的基因突变或基因重组技术与定向的突变体筛选方法相结合的分子进化技术。步骤制备突变体文库突变体文库在适当的表达系统内表达。筛选突变体方法易错PCRDNA或基因改组DNASHUFFLING14如何利用易错PCR发生突变体文库（一）易错PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。提高镁离子浓度。加入锰离子。改变体系中的DNTPS浓度。运用低保真度DA聚合酶等。增加碱基错配的方法易错PCR的概念易错PCR成功的关键选择合适的突变频率。一般目的基因突变15个时，诱变结果理想。嵌套易错PCR，使其PCR错误积累。15什么是DNASHUFFRING技术DNASHUFLING体外同源重组技术。将来源不同但功能相同的一组同源基因，用核酸酶消化成随机片段，由这些随机片段组成一个文库，使之互为引物和模板进行PCR扩增，当一个基因拷贝片段作为另一基因拷贝的引物时，引起模板互换，重组因而发生，导入体内后，选择正突变体作为新一轮的体外重组。17基因工程药品的种类基因工程药物干扰素，生长因子、胰岛素等基因工程疫苗基因工程抗体基因工程药品特点高技术、高投入、长周期、高风险、高收益二、问答题1克隆制药基因涉及的基因工程技术有哪些2如何获得制药基因制药基因的获得一般分为直接获得和间接获得。直接获得是指从DNA直接获得，通常针对原核生物的基因。因为原核基因为连续基因，无内含子；间接获得是指利用MRNA、CDNA等，针对真核生物的基因，真核基因为断裂基因，有内含子；3连接酶的作用机理是什么DNA连接酶催化其之间形成磷酸二酯键来形成DNA重组分子。4什么是限制性内切核酸酶的星号活性受哪些因素影向5什么是KLENOW酶有哪些活性在基因工程中有什么作用6什么是同聚物加尾连接法所谓同聚物加尾法就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸7PCR反应体系包含哪些物质包括7种基本成分（1）热稳定DNA聚合酶（2）模板DNA（3）寡核苷酸引物（4）脱氧核苷三磷酸（DNTP）（5）二价阳离子（MG2）（6）维持PH值的缓冲液（TRISHCLPH8388（7）一价阳离子（KCL70100MMOL/L）8PCR反应的原理是什么原理是在模板、引物、4种DNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）。9PCR引物设计的原则是什么10影响PCR结果的因素有哪些（1）温度循环参数（2）引物（3）影响酶活力的因素11载体的种类有哪些各有什么特点12转染的方法有哪些13什么是电穿孔基因转移技术什么情况使用电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。即利用脉冲场将DNA导入培养细胞。电脉冲和场强的优化对于成功的转染很重要。14什么是脂质体转染法什么情况使用脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点将药物送入细胞内部。阳离子脂质体