DB21T 1693-2008 食用菌液体菌种生产技术规程

  案号：  辽 宁 省 地 方 标 准   1693 2008 食用菌液体菌种生产技术规程  2008布  2008施  辽宁省质量技术监督局  发布   1693 2008 I 目     次  前言  .  范围  . 1 2 规范性引用文件  . 1 3 术语和定义  . 1 4 技术要求  . 3 5 接种三级固体种袋（瓶）和栽培袋（瓶）  . 8 6 记录与存档  . 8 7 贮藏运输  . 8 8 操作人员培训  . 9  1693 2008      言  本标准的编写原则是依据 2000标准化工作导则  第 1 部分：标准的结构和编写规则及 2002标准化工作导则  第 2 部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法而制定的。  本标准由大连市质量技术监督局 提 出。  本标准由大连市质量技术监督局归口。  本标准由大连春天生物技术有限公司负责起草。  本标准主要起草人：李东海、孙建军、韩玉才。  本标准属首次发布。   1693 2008 1 食用菌液体菌种生产技术规程  1 范围  本标准规定了食用菌液体菌种生产厂房设施、生产设备、品种、生产工艺流程、技术要求、储藏运输和操作人员 培训。  本标准适用于食用菌液体菌种的生产。  2 规范性引用文件  下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。  品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂  活饮用水卫生标准  品包装用聚乙烯成型品卫生标准  品包装用聚丙烯成型品卫生标准  净厂房设计规范  12728用菌术语  制压力容器  528用菌菌种生产技术规程  3 术语和定义  下列术语和定义适用于本标准。  用菌液体菌种培养器    称之为液体菌种发酵罐，是指进行食用菌液体菌种培养的专用设备。要求不锈钢材质，符合1998 钢制压力容器标准。  动式 食用菌液体菌种培养器  在食用菌液体菌种培养器上安装了可移动的装置，培养器工作时能整体移动，而移动中又不影响培养器的性能。  用菌液体菌种接种器  指能将液体菌种从培养器中按无菌操作要求转接到食用菌固体培养基物料上的设备。  气压缩机   能为培养器提供压缩空 气的设备。  气过滤器   能对培养器所用空气进行过滤的设备。  压  食用菌液体菌种培养过程中培养器保持的空气压力，单位：   1693 2008 2 风量 液体菌种培养过程中每分钟通入培养基中的无菌空气的量。用 V/V（培养基体积 /通入空气体积）标示。  种量  接入培养器中的菌种的数量，以菌种体积与培养基体积的百分比标示。  体菌种菌龄   of 指菌种接入培养基开始计算的液体菌种生长发育时间。  罐  将内置电热棒式培养器加水后，进行高压蒸汽灭菌处理。  养器空消   对用外源蒸汽灭菌，尚未加水投料的空培养器进行高压蒸汽灭菌。   养器实消  对投料后的培养器进行高压蒸汽灭菌。  料  将配置好的培养基投放到培养器中。  容  培养器中加入培养料后，加水至所要求体积。  料  从培养器放料口排出培养料。  罐  培养结束，将液体菌种从培养器内排出，接种到三级固体种袋（瓶）或栽培袋中。  瓶液体种  in 装在玻璃三角瓶内在摇床上恒温振荡培养的液体菌种。  体专用种  在玻璃三角瓶或聚丙烯瓶固体培养基内生长的纯食用菌菌丝体培养物。专供接入液体菌种培养器用。  始   pH 液体培养基配制后尚未接种时的 。  检  通过显微镜观察食用菌菌丝生长发育状态和有无杂菌污染的过程。  热棒灭菌  用培养器内安置的电加热棒加热灭菌的方法。  源蒸汽灭菌  用锅炉蒸汽给培养器灭菌的方法。  体专用种并瓶   将检验合格的固体专用种按无菌操作要求，转移至装有无菌水的大三角瓶中，充分搅拌呈均匀的液态菌种的过程。  角  培养器蒸汽灭菌时未能达到彻底灭菌的地方。  压回零  to  1693 2008 3 指液体菌种培养过程中，培养器内压力回到零点或成负压。  油去湿  用专用设备将压缩空气中的油污和水分除去。  4 技术要求  术人员  体菌种生产厂应有与液体菌种生产所需的专业技术人员。  作人员 卫生要求  作人员应该保持良好的个人卫生，勤洗澡、勤换衣、勤理发、不保留长指甲。  车间必须穿戴经灭菌的工作服、口罩、鞋、帽。  禁在车间内吸烟、随地吐痰和乱扔杂物。  体菌种生产厂房  厂房设计达到 528准要求。  址要求  食用菌液体菌种生产车间必须建在交通方便，水源和电源充足，无有害气体、烟雾、灰沙，远离垃圾场、畜禽场舍的地方，有硬质路面排水良好的道路。  用菌液体菌种生产车间必须建在交通方便，水源和电源充足，无有害气体、烟雾、灰沙，远离垃圾场、畜禽场舍的地方，有硬质路面排水良好的道路 。  间地面应能防水、防腐蚀、防渗漏、防滑，易清洗，有适当的排水坡度（  和良好的排水系统，排水沟必须是圆弧式的明沟。  壁和天花板应能防潮、防霉、防水、易清洗。  窗应设置防蚊蝇纱网。  间入口处应设置洗手、消毒和干手设施。  间安装排气管道或者排风设备。  体种菌种接种间必须设置缓冲间。  设置与职工人数相适应的更衣室、浴室、厕所和工作休息室。  间设封闭式废物桶。  酵间按照 净厂房设计规范执行。  种间按照 净厂房设计规范执行。  体栽 培种的灭菌间、冷却间、培养间符合 528用菌菌种生产技术规程要求。  产设备与设施  本生产设备  培养器、空气压缩机、空气过滤器、液体菌种接种器、高压蒸汽灭菌锅、蒸汽锅炉、净化工作台、恒温摇床、恒温培养箱、冰箱、显微镜、磁力搅拌机、磅秤、天平、酸度计等。在经常停电的地方应有自备电源（发电机）。培养器、高压灭菌锅和蒸汽锅炉应使用经政府有关部门检验合格，符合国家压力容器标准的产品。  用生产用具  玻璃三角瓶、接种器、接种用火环圈、试管、量杯量瓶、玻璃漏斗、定量定性滤纸、精密 纸等生物实验室 常规用品。  本设施  配料间、发菌间、冷却间、接种间、培养间规模要配套，布局合理，要有调温设施。  验室和菌种室  化验室和菌种室要有相应的实验检测设备和制种用的灭菌设施和常规用具。   1693 2008 4 于 接种  器内  检验符合  放罐标准  罐压        温度 24 26  通风量  1： 1： v/v）  无菌  空气  除油  去湿  并瓶  检验合格     磁力搅拌  接种                    26 28  121   123   高压蒸汽灭菌 40容    投料  振荡培养 3d 5d      经镜检符合标准         检验  合格  液体菌种专用培养基  空  气  摇瓶液体种  调   制  压  缩  机  固体专用种  灭   菌  高压灭菌  过滤器  冷   却  培  养  器  液体菌种培养  合格液体菌种  三级固体种袋（瓶）  栽培菌袋  液体菌种生产工艺流程图  母  种  养原料  符合 528用菌菌种生产技术规程要求。  学试剂类  符合 528用菌菌种生产技术规程要求。  物制剂和天然材料类  除符合 528不溶性固体物料要过 40目筛。  产品种  符合 528用菌菌种生产技术规 程要求和 12728用菌术语相关规定。  应使用经省级以上农作物品种审定委员会登记的品种，并且从具有相应技术资质的供种单位引种且种性清楚。不应使用来源和种性不清或者生产性状未经系统验证的组织分离物作为菌种进入大规模生产。  体菌种生产工艺流程  产过程工艺要求  器  种  使用玻璃试管和棉塞，试管 18180 20200塞要使用梳棉，不应使用脱脂棉。  用固体种和摇瓶液体种   1693 2008 5 使用 5001000 126高温 的无色或近无色的玻璃菌种瓶。各类容器都应使用棉塞，棉塞应符合 定；棉塞外要加盖 4 层纱布，灭菌时纱布外加盖牛皮纸防潮。  养基配方  种培养基  一般使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ 综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ 特殊种类需加入其生长所需特殊物质，如酵母粉、蛋白胨、麦芽汁、麦芽糖等，但不应过高，严格掌握 。  固体专用种和摇瓶液体种培养基。  体专用种和摇瓶液体种培养基  按 据当地原料资源和所生产品种的要求，使用适宜的培养基配方，严格掌握含水量和 水 符合  装  母种培养基的分装量掌握在试管长度的四分之一至五分之一，灭菌后摆放成的斜面顶端距试管口不少于 50体专用种养基装至距瓶（袋）口不少于 60菌后不少于 45塞大小松紧要适度。培养基的松紧度要一致。摇瓶液体种培养基装量应为容器体积的 1/4。  菌  母种和固体专用种、摇瓶液体种培养基配制分装后应立即灭菌。母种培养基灭菌 0体专用 培养基灭菌  1h。  装容量较大时，灭 菌时间要适当延长。灭菌完毕后，应自然降压，不应强制降压。母种培养基、专用种培养基，应高压灭菌，不应常压灭菌。灭菌时应防止棉塞被冷凝水打湿。  菌效果的检查  母种培养基置于 28恒温培养，固体专用种和摇瓶液体种培养基经无菌操作接于前面 2003 中 定的营养肉汤培养基中，于 28恒温培养， 48h 后检查，并经显微镜镜检确定无微生物长出为灭菌合格。  却  冷却室使用前要进行清洁和除尘处理。地面铺消毒过的塑料薄膜后，将灭菌后的专用种瓶放置在冷却室中冷却到料温降至适宜温度。  种  种室（箱）的 基本处理程序  清洁 搬入接种物和被接种物 消毒处理。  化工作台的消毒处理方法  先用 75%酒精或新洁尔灭溶液进行表面擦拭消毒，然后开紫外灯灭菌 30 种操作  在无菌室（箱）或净化工作台上严格按无菌操作要求接种。接种完成后及时贴好标签。  种室（箱）后处理  接种室每次使用后，要及时清理清洁，排除废气，清除废物，台面要用 75%酒精或新洁尔灭溶液擦拭消毒，然后开紫外灯灭菌 30 养室处理  在使用培养室的前两天，采用药物消毒。  养条件   1693 2008 6 根据不同培养物的不同生长要求，给予其适宜的培养温度（多在 22 28），保持空气相对湿度在 65% 75%，通风，避光。摇瓶液体种置摇床上振荡培养，振荡频率随具体品种而定。  养期的检查  各级菌种培养期间应定期检查，及时拣出不合格菌种。  库  完成培养的母种和固体专用种及时登记入库。  录  生产各环节应详细记录。  样  各级菌种都应留样备查，留样的数量应以每个批号母种 3 支 5 支，专用种 5 瓶 7 瓶（袋），于 46下贮存，贮存至经转接的栽培种袋（瓶）或栽培袋（瓶）至正常发菌。  气过滤器  采用超高效空气过滤器。  质要求  滤器外壳： 321 不锈钢制造、内 表面电子抛光，外表面镜面抛光处理。  滤芯在额定风量下，对粒径 m 粒子的捕集效率，在 上。空气阻力在 280下。所有材质应耐 126高温。  查  使用前要拆分检查滤芯，要求无油污、料污、无破损，外壳内外壁要求无污物、光亮洁净。  菌  高压蒸汽灭菌 121 123、灭菌 40 养器检查与清洗  查  检查罐上全部阀门、安全阀、压力表、要求完好，工作正常。  洗  对罐体内、外和全部阀门用流水进行冲洗，达到无死角、内壁无任何培养料残余物的洁净程度。  罐和空消  培养器初次使用、出现染菌、长期放置、更换品种时，都要求煮罐和空消进行灭菌。有内置电加热棒的培养器加水至容积的 80%加热至 121，灭菌 40外源蒸汽灭菌的培养器，度 121 124、 40 体菌种培养基配方  材料符合 528 2002 标准要求。  具体配方根据当地原料资源和生产品种的营养需求，使用适宜的配方，准确掌握加水量。用水符合2006，生活饮用水卫生标准。  始   常见食用菌品种，培养基调节起始  料与定容  将配制好的培养基材料，加适量温水，搅拌均匀，倒入或用泵抽入培养器中，加水定容至所需体积，培养基投料量为罐体总容积的 70% 80%，然后拧紧上料口盖。    1693 2008 7 养器实消和培养基灭菌  培养器内蒸汽压力达到 养基温度达到 121 124、保持时间 40止灭菌死角。  料  有内置电加热棒的培养器灭菌时，当料温达到 121时从排料口将高温料液小流量排出，维持30排料量为总体积的 4%左右。  却降温  灭菌结束将冷水通入培养器夹层或者内置冷却系统中循 环，使培养基降温至 24 28。注意降温过程中要及时向培养器内通风防止罐压回零。  体专用种并瓶  选择无污染、菌丝生长正常、质量合格的固体专用种进行并瓶。并瓶应在无菌室或超净工作台内按无菌操作要求进行。  种  利用火焰保护接种法，把火圈放在投料口的上方点燃，此时打开进料口盖，把并瓶后的专用种迅速投入罐中，然后，迅速把上料口盖盖好，拧紧。移走火焰圈，接种完毕。液体种进入培养阶段。  体菌种培养条件  节通风量  通过进气阀和排气阀将通风量调节至 1： V V(料液体积空气体积 )。  节罐压  调节罐压保持在 间。  养温度  常见品种培养温度调节在 24 28范围内。少数品种根据特殊需求具体设定。  养时间  一般品种在上述条件下培养 3d 5镜检等方法检验质量合格即可放罐接种。特殊品种的放罐菌龄，可根据该品种在培养器内菌丝的生长发育状态和其它理化指标变化情况具体确定。  样与检测  样  并瓶后的菌种样品；培养器灭菌后的空白培养基样品；培养过程中定期从培养器中取出的样品，用作镜检和其它理化指标测定。上述样 品放冰箱内保存一周以上。  菌检测  对上述留存样品应在无菌检测琼脂平板上划线培养，在 28恒温培养 2d 5d，每天观察菌落生长情况，若划痕上没有细菌、霉菌、酵母菌菌落生长，则表明该样品无杂菌。对留样样品应在取样后及时镜检，确定菌丝生长发育状态和有无杂菌污染。     采用酸度计测定，应在规定范围之内。  丝湿重  采用 15定量滤纸，将 100体菌液，过滤至无水滴滴下，称重后减去滤纸湿重。  检   1693 2008 8 采用显微镜，低倍、高倍、油镜，观察菌丝生长状况和有无杂菌污染。  体菌种放罐指标  官指标   见表 1 表 1 感官指标                                    项   目  指     标  菌液色泽  球状菌丝体呈白色，滤液呈棕色。  菌液形态  菌液稍粘稠，有大量片状或球状菌丝体悬浮、分布均匀、不上浮、不下沉、不迅速分层，菌球间液不混浊。  菌液气味  有食用菌液体培养时特有的香气，无异味，如酸、臭味等  培养器排气口气味正