课题3　分解纤维素的微生物的分离 (8)

,纤维素：棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物；,纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨；分布在植物的根、茎、叶中。,2.3分解纤维素的微生物的分离,1、简述纤维素酶的种类及作用。,2、掌握从土壤中分离出分解纤维素的微生物的实验方法。,3、讨论这类微生物的应用价值。,阅读教材P27，思考：,1、说出纤维素的化学组成和分布。,2、人、兔、牛、蘑菇谁能利用纤维素？为什么？,4、纤维素酶的组成如何？有什么作用？怎样验证它的作用？1U表示的含义是什么？,3、纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，但却不会在地球上大量的积累，为什么？,5、研究分解纤维素的微生物有什么意义？,一、纤维素和纤维素酶,1、筛选纤维素分解菌的方法是_。该方法可以通过_反应直接筛选。,刚果红染色法,颜色,如何筛选纤维素分解菌？依据什么原理？,二、纤维素分解菌的筛选,2、其原理是：刚果红可以与纤维素形成_，当纤维素被_分解后，红色复合物无法形成，出现以_为中心的_，我们可以通过_来筛选纤维素分解菌。,红色复合物,纤维素酶,纤维素分解菌,透明圈,是否产生透明圈,三、实验设计,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布到鉴别培养基,挑选菌落,什么样的环境取样？,培养的目的？选择培养基的特点？,挑选什么样的菌落？,鉴别培养基的特点？如何鉴别？,根据：微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找。,目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。,刚果红染色法,思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？,本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在鉴别培养基上。其他步骤基本一致。,四、结果分析与评价,培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落？对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。,为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_实验，纤维素酶的发酵方法有_发酵和_发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的_含量进行定量测定。,发酵产纤维素酶,液体,固体,葡萄糖,五、课题延伸,分解纤维素的微生物的分离,纤维素酶,组成、作用,刚果红染色,筛选原理,实验设计,土壤取样,选择培养,涂布培养,纯化培养,前置染色法后置染色法,富含纤维素土壤,增大纤维素分解菌含量,染色鉴别,分离出分解菌,将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择培养基上,将细菌培养在纤维素粉为主要碳源的选择培养基上,固体培养基,液体培养基,筛选菌株,选择培养，增加浓度,分离纤维素分解菌的培养基和分离分解尿素的细菌的培养基的比较。,细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚红指示剂，指示剂会变红,刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后，红色复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈,观察菌落周围是否有红色的环带出现来鉴定尿素分解菌,观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌,尿素为唯一氮源的培养基上加入酚红指示剂,刚果红染色法,1、下列关于纤维素酶的说法，错误的是(),A、纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B、纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C、纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D、葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖,2、利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是(),A、刚果红能与纤维素形成红色复合物B、刚果红能与纤维二糖形成红色复合物C、刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D、若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌,D,B,3、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪一生物学观点？（）A、生物结构与功能相适应的观点B、生物结构与功能整体性观点C、生物与环境相适应的观点D、生物发展进化的观点,4、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（）土壤取样梯度稀释选择培养菌悬液涂布平板挑选出单个菌落A、B、C、D、,5、有关选择培养正确的叙述是（）,A、可以增加纤维素分解菌的浓度B、可以减少纤维素分解菌的浓度C、所用培养基是固体培养基D、所用培养基是平板培养基,C,B,A,完成相关练习,（1）纤维素的化学组成,纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。,植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。,1、说出纤维素的化学组成和分布。,（2）纤维素的分布,免、牛、蘑菇能利用纤维素。因为在草食性动物的消化道内共生有分解纤维素的微生物，这些微生物产生的纤维素酶分解纤维素；而人的消化道内没有这些微生物；蘑菇自身产生纤维素酶分解纤维素。,2、人、兔、牛、蘑菇谁能利用纤维素？为什么？,3、纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，但却不会在地球上大量的积累，为什么？,纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。,纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶,4、纤维素酶的组成如何？有什么作用？怎样验证它的作用？1U表示的含义是什么？,（2）纤维素酶的作用,（1）纤维素酶的组成,取二支20mL的试管,各加入一张滤纸条,各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液11ml和10ml,甲乙,在乙试管中加入1mL纤维素酶,两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min的摇床上振荡1h,结果：乙试管的滤纸条消失,（3）纤维素酶作用的验证实验,实验分析：本实验是如何构成对照的？,在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的pH。,（4）1U表示1个酶活力单位，是指在温度为25，其他条件，如pH等，均为最适的情况下，在1min内转化1mmol底物所需的酶量。,a.能够利用秸秆等废弃物生产酒精。b.用纤维素酶处理服装面料等。,5、研究分解纤维素的微生物有什么意义（应用价值）？,分布环境,富含纤维素的环境中,生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。,原因,（P28旁思：为什么在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？）,土壤取样,讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？,将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。,实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。,土壤取样,选择培养,1、选择培养的目的：,增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。,2、制备选择培养基,参照课本29页旁栏中的比例配置，回答下列问题,a、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？,b、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？,c、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用,是液体培养基，原因是配方中无凝固剂,有选择作用，本配方中的碳源是纤维素，所以能分解纤维素的微生物可以大量繁殖,用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,3、具体操作：,将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养12天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。,在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。,旁栏思考4为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？,选择培养,梯度稀释,按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数到106,将样品涂布到鉴别培养基上,1、制备培养基:参照旁栏中的比例2、涂布平板：将稀释度为104106的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，30倒置培养,方法一：先，再加入刚果红进行颜色反应。方法二：在时就加入刚果红。,培养微生物,倒平板,方法一中NaCl溶液的作用？,漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。,这两种方法各有哪些优点与