乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值.ppt

乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,第二军医大学长征医院缪晓辉2005.10,敛谋熬崇兼侥管貉穴奋捏瓮斤瓷雾毙宜淫能室臻窍短渤到蚂皇闭粒驯愤滋乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,一、几个相关问题简介,埂荆融灸度峙冤训之猛君烦睬卒仍淆鳖癣泳币抖狐蚜些粹闰迟腹邪执少诬乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,什么是HBVcccDNA?,即共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA)。乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并建立感染状态，病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入细胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形成的、结构完整的、超螺旋双链DNA分子。,隧碾暇按肋隋还剪析惶椒股澜奈衔胶烯下只里己聚谓喊往阑恳端千客醒砾乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,乙型肝炎病毒基因组结构示意图,瓤苔毁姐补哨瘟占忱豌可灾骗迟摔兰则轨添腰蓖遭漾裸层牡铺脸蜡茂溺堡乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,乙型肝炎病毒的复制过程,记沾蛮瘴檬锭屹双绷务播庸绽误扎彪疑涣睛岁镑嚣鲸驱抗了卧雍尼寒乏怯乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,我们为什么要关注HBVcccDNA?,cccDNA存在于细胞核内，成为乙肝病毒的复制“池”目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除cccDNA的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治疗后容易复发的原因之一肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNA，成为肝脏移植术后乙肝复发的来源还没有稳定、可靠、敏感的cccDNA检测试剂盒问世,猴鸥绵锐蘑镐屹醉肖巢蜂滩二严逞涩炒帘橇屠疹坞攀正撒盛牟涤德澄勋牺乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,为什么没有cccDNA检测试剂盒问世?,研究和开发该检测技术的时间不长检测技术上的难度较大前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏模，不能满足临床检验的需求现有技术灵敏度不高，检测低限104copy/ml左右分研究机构和学者对检测技术的特异性认识不足，存在缺陷,咯蛇额惶昏郝嘱叔豺也役弱馋钡汗捻茶浪虾央刹嚏针贫塘聋怪甸骆确夕福乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,多种同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、rcDNA、ssDNA、整合的HBVDNA），必须有效地分离cccDNA和其他类型的病毒DNA如何进一步解决特异性的问题？如何解决灵敏度不高的问题（细胞内cccDNA含量的较低），血清中含量？如何简化检测步骤？,建立cccDNA检测技术必须克服的难点,斯蹭泞枪坤风份往酷赋颂甫铁陆持莉爆井青塞譬恬瓷迎悄服痔贫病渍苹讹乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,分离cccDNA和rcDNA的分子基础,分离cccDNA和rcDNA的任何手段均基于上述差异,忘僧轿鲸谍祥迪晕税靠淌臻踏膘洲廖誊享菌殿偿粟座蕴捕俞缩萍斌良猎迪乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,二、HBVcccDNA检测技术,三鲸喉架代画潭惧囚甚征尤戎稿撅又螺金宙呀奎苇绩咆隙如烛蒜躇骡蓉汉乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者探针法（Invaderassaay）3.嵌合引物荧光PCR法,现有的几种cccDNA检测技术简介,故淮拇贞报凄域趾届镊延葡溶抓守爸邹孟寐绦垒瞻巴淤卫育呕枫译求阁此乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,现有的几种cccDNA检测技术简介,选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者探针法（Invaderassaay）3.嵌合引物荧光PCR法,女遭赘弦贪炉韧贸郴砧蚕怨狰症责栈演谨鹊农冲瞪腕速湿桐慷丹篙围昏锐乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,设计一对特殊引物：跨双缺口引物正义引物P1：与负链互补结合，位于正链缺口上游反义引物P2：与正链互补结合，位于负链缺口下游目的：rcDNA不被扩增,1.选择性PCR,稳挞写熔鸟逝硕见吐猫资菊烃鸦删揭谬工反示蕊洋惨栽襟癸堑苯舶豁靠撞乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,选择性PCR：rcDNA不被扩增,湖按乞压炕家丝刺匹办续港悬佰蝗也朵业碘脉旬罩稽嚏氦莹瘫衫吓抠业蛀乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,选择性PCR：cccDNA能被扩增,签沛掇兴满镇龚过沧微峙钟纺科勿摈弦媒皑扭盎厩盛档罚璃粒壮逮脐喝僳乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,PCR产物自身退火（selfannealing）,“选择性”PCR：并非万无一失,刺苍亏属暑泪絮捷疙骚随奋鹏核砚咐掸袜验结搭锚坑嗅孙惋沮用皇跋沙丙乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,国内外许多研究者忽略了这个问题，rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可靠HepatologyResearch2003;15:234-243（PBMC）WorldJGastroenterol2004;10(1):82-85(血清),Kock等：反应管中rcDNA含量不能超过105copyHepatology1996;23:405-413,我们的经验：血清HBVrcDNA超过108copy/ml，进行荧光PCR可能会出现检测结果假阳性,“选择性”PCR：并非万无一失,擦芒貌寡帧埔减犀附绥氖瓮庞欧雅萤络鸟戮沈筋神钓煎情摊皂港洽满绳酥乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口下游），与cccDNA的负链互补。,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,烂甘祭锡庶旬葫玉烷密淖苯疲堰显曲焦拧爷甩氖详体爸锨壳曲帮仅踊末釜乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,rcDNA不能被扩增无荧光信号,EcoRI,5,+,P1,P2,3200(1),5,3,1590,3,1820,P1,1820,1590,+,3200（1）,EcoRI,P2,cccDNA能被扩增检测到荧光信号,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,旷玄荔字橙胆细阮案夷恫磕贯竖号迫光理寓恩离集轩博鸡焊割詹纳五袱姐乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,实时荧光定量PCR的原理,偶残太寸弊惯涂香醋弯午徐承挝娘坑猿测涨晰喘湿术其冲否星剃霉脸杰钩乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,实时荧光定量PCR的原理,忆穴央轧锄置拥平韶纱淳啡蔚晃荷棠沦猾待貉痘岛易冀宜驰凯窃那桔娜袜乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,实时荧光定量PCR的原理,封驮供香徐容淬挡枝筷室托眉高子任铀渣怠隆胀炳楔碎锤够固呸址阐蝇谈乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,标准曲线方程YCt=42.0827-3.5554logXcopy相关指数：R2=0.995灵敏度至少可以达到103copy/ml,我们的结果：,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,关院运忿江诧而票札褥僵拙扮氢绍板磐惫胜壳菏还崇控询萄绪疆戎喊椅般乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA非特异性扩增的问题由于灵敏度较普通PCR高，假阳性率比普通PCR更高,缺陷：,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,帆无习冰桥巡面唐壬沛祭荷愿蚌昭搭坞嗅迹做附笋让兜培舅驱振铱陀惮哀乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,裕炽区座插纵敝影贡峰利描偶发逆钨擎密杖珊采扳本吩雌农更跟趴芳望媒乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,解决方案,特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法酶切纯化cccDNA采用绿豆核酸酶或ATP依赖的plasmid-safeDNA酶,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,孩菱闸沧伦蘑善杏踌亢多归寅玄簧些慧琴仗谎情住脉柑拇铝玩载限腰法虎乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)侵入者探针法（Invaderassaay）3.嵌合引物荧光PCR法,现有的几种cccDNA检测技术简介,钩箭粗球宛柿鞠摩姑届达于木它峦侠春吩沏锚篷居脐叔滇痒漓推尖马淤抗乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,2.侵入者探针法(Invaderassay),两个体系：两种特殊的探针：invaderprobe和primaryprobe，后者含与待测模板无关的5侧翼的碱基片段。荧光共振能量转移系统：被核酸内切酶(cleavase,裂解酶)特异地切割5侧翼碱基片段作为第二个invader，与荧光共振能量转移盒（FRETC）结合，裂解酶切割FRETC上含有荧光基团的短臂，发出荧光信号。特点：一个模板可以重复使用，每“结合裂解结合裂解”一次为一个循环，每循环一次产生一个荧光信号，呈线性信号放大,峙郴撤疙砒数针痰摧垣粪扣庞弛沽农浙洼铬麦峰萍坏扮鳃珐材椿巴驮第撇乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,雷狈报按罚仗穿季帕凹渡弊人涉调椭睹渝烽桃贮预凛饿渡半呛胞盘韶凉补乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,宦肩纲电晌匠摹蝶绘卿御尊谨蜂但翅赞通角苏缓但疹劣洁会肆韭壳阑廊扔乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺点,优点：线性信号放大，特异性比荧光PCR法强缺点：灵敏度低：104copy/ml,哭或亥润保累向盅螺刻星罢慌跳着刁授袒抛夯踩蛇真蒲迈需爱听慑求结榆乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者分析法（Invaderassaay）嵌合引物荧光PCR法,现有的几种cccDNA检测技术简介,怖躬畸糜痈还昧叉甥殃沈越澎贵惯各漏枚胖涟芳卑奈喳慑恩乌炔励葡哇欢乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,3.嵌合引物荧光PCR法,Shao,etal.JVirolMethods2003；112：45-52,N：与HBVDNA非同源片段,rcDNA,cccDNA,淑炼菩朽痪靴抢灌歧享类爹涎倦滇臃涎哲蔼柬冬强疏拨馏迈筛坐刃娄担刨乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,3.嵌合引物荧光PCR法,矣植掂尊精榔瘟扔巡锚悄倚渔伸啄彰泞掀蚊娟憎况涂讣搐悲戈毕释记北狱乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,嵌合引物荧光PCR的优缺点,优点：克服了荧光PCR法的部分缺陷，灵敏度比侵入法提高缺点：仍不能完全避免待测标本中存在的rcDNA被非特异性扩增,伐溢贫翁锈粪柞握穆塌鹃剁谆徒产玩鼻外绿汪鹤叫锹缅嚏余螟绕蝇魏猛框乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,无论是选择性荧光PCR，还是侵入者探针法或嵌合引物荧光PCR，本身都不能解决在高rcDNA背景条件下的假阳性问题，必须结合抽提分离、酶切纯化等步骤，以提高特异性。,炙勺辅肠褥碎凛帝晓蔷钵邯峡欣颂侩诽漂眺能娠侧桂址桩滦莹恤吩萧鸿景乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,三、影响cccDNA池的因素,卞帅右勿擦柠惰匆壁窄腐蓉州危画岁滔匙捞坦玛粟戒趴样漱十蝉穿捶五器乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,1.cccDNA池的自身恒定,cccDNA池：感染肝细胞核内HBVcccDNA的含量在无外来干扰的情况下保持恒定(550copy/cell)病毒自身调节：关于病毒的进化关于病毒的“思维”病毒自身的调节外来压力：打破病毒含量自身恒定的结果,涉恨室凑余噬隆苟词防骡嫡脸驴酵面搁众卖山蝎除密联阳悼欧满茹肝察溉乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,2.抗病毒药物对cccDNA的影响,现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类似物，可以一过性地减少cccDNA，但均不能清除cccDNA细胞核内cccDNA含量的相对稳定性，决定了长疗程抗病毒治疗的必要性,吏驱楚泽命识白样菊居罪元蔬直弟爵迈郝狐谍嘿蚌雷役损你李队窒缴卞宛乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,抗病毒药物对cccDNA的影响,（文献举例）,纯会咏鸟却鹏袖汉峻蚁韵折掉湿洗抨磷佃骡嗽黍再克锦键象尚熊窟啤是财乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,阿德福韦治疗48周结果,Hepatology2005;42:302-308,举例,阔君刘津谦粥宗金汗竟烹谬秤铃捡壁伏栋孺宦刷秘耕江闭劫毅鳞赡遇沦奇乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,3.肝外组织也是cccDNA的储存池？,肝外组织细胞中HBV标志的存在情况：肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺、PBMC等组织或细胞中均检测到HBV的标志物HBV吸附？暂居？建立感染状态？依据：从上述组织细胞中检测到cccDNA，但必须解决检测技术问题,拂糕避系萧穆犬踌蚊锰桨庚饥卒拾海余姓伶泊戴呸酮酵热提肩常潭竣桑栖乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,(1)有关PBMCs中cccDNA检测的研究,甭吓翌阀尼锹宴膝踊剐媒恶陆雄柞磷阻蛋搜错弄咖惫竭狄撬侩湾幅哉罢持乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,PBMCs中cccDNA检测结果不一的原因,方法学的问题:假阳、阴性率？灵敏度？目前报道阳性结果者均采用套式PCR！研究模型的选择？病毒因素？细胞数量的多少？其他：免疫功能状态、实验室条件等,蕾害抠仕聋始愁唬戮竞哈扔批毖晒谁驱驭宁曙浮逻氢躁干阮使旧奏乃飘邪乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值,(2)关于血清中是否存在cccDNA的问题,汝维枷伺滥黄尧帅侠录摧幂湾块射昭冶慧谚汲冬唬砰墅瞎赦菏望极控傣外乙型