生物化学1.糖的化学

1,生物化学Biochemistry,主编吴梧桐人民卫生出版社第6版,暨南大学医学院生化系陈万群,2,生化理论课考核方式：平时10%、讨论20期末考试70实验课考核方式（实验从第2周开始）预习报告、出勤20%平时实验80%指导书：教研室自编英文教材（教材科）实验时间：周五下午2：30实验地址：医学院大楼7楼717、718、719第一次实验：蛋白质定性及酪蛋白等电点测定实验exp2和3,3,生物化学biochemistry,涵义：一门主要用化学的理论和方法，在分子水平上研究生物体的化学组成，探讨生命活动过程中化学变化规律和生命的化学本质的学科。,生命的化学,4,二、生化研究的主要内容,1.研究生物体的物质组成及生物分子的结构与功能；2.物质代谢、能量变化及其调节；3.遗传信息的储存、传递与表达。,5,药学专业为什么要学习生物化学？,Alldiseaseshaveabiochemicalbasis.,6,三、生物化学与药学的关系,疾病,生物化学,药学,药物研发,剂型设计，用法用量,7,第一章糖的化学,8,第一节概述,一、糖的概念、分布及主要生物学作用概念：由碳、氢、氧三种元素组成，是多羟基醛或多羟基酮及其聚合物和衍生物的总称。常可以写成（CH2O)n，也称碳水化合物。例外：如鼠李糖、脱氧核糖等分布：含量多，分布广。,9,10,葡萄糖的存在形式,-D-吡喃葡萄糖,-D-吡喃葡萄糖,-D-呋喃葡萄糖,-D-呋喃葡萄糖,63.6%,36.4%,0.01%,1%,11,糖的主要生物学作用：是人和动物的主要能源物质。淀粉、糖原、葡萄糖等具有结构功能。纤维素、壳聚糖、粘多糖等具有多方面的生物活性及功能。戊糖、FDP香菇多糖、猪苓多糖、肝素等,12,二、糖的分类（根据含糖单位的数目）,单糖（monosaccharide)：不能被水解成更小分子的糖。寡糖（oligosaccharide):由单糖缩合而成的短链结构（含26个单糖）多糖（polysaccharide）：由许多单糖分子缩合而成的长链结构，分子量很大，均无甜味也无还原性。,13,1.单糖,丙糖甘油醛和二羟丙酮。丁糖D-赤藓糖和D-赤藓酮糖戊糖戊醛糖：D-核糖、D-木糖、D-2-脱氧核糖戊酮糖：D-核酮糖、D-木酮糖己糖己醛糖：D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖己酮糖：D-果糖庚糖D-景天庚酮糖,14,半乳糖,果糖,葡萄糖,15,2.寡糖(oligosaccharide),(1)二糖:两分子单糖以糖苷键连接而成,蔗糖(sucrose)G（葡萄糖）+F(果糖),麦芽糖(maltose)GG,乳糖(lactose)G+Gal（半乳糖）,16,（2）三糖:棉子糖（半乳糖、葡萄糖、果糖组成）棉子、桉树，甜菜中存在3.多糖(polysaccharide)多个单糖分子缩合而成的长链结构，分子量很大，均无甜味和还原性。有旋光性。淀粉(starch)、糖原(glycogen)、纤维素(cellulose)复合糖（非糖物质结合的）：糖蛋白、糖脂,还原性糖种类：还原性糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖等。非还原性糖有蔗糖、淀粉、纤维素等，但它们都可以通过水解生成相应的还原性单糖。还原性糖概念：指具有还原性的糖类。在糖类中，分子中含有游离醛基或酮基的单糖和含有游离醛基的二糖都具有还原性。葡萄糖分子中含有游离醛基，果糖分子中含有游离酮基，乳糖和麦芽糖分子中含有游离的醛基，故它们都是还原糖。斐林试剂和班氏试剂都是检验还原性糖的试剂，二者的使用方法及原理、成分有区别，与还原糖均生成砖红色（沉淀）。还原糖和非还原糖的概念：凡是对斐林试剂、土伦试剂、本尼迪特试剂呈正反应的糖称为还原糖，呈负反应的糖称为非还原糖。,18,第二节多糖的化学,一、多糖的分类（一）多糖（按来源）分类1.植物多糖:水溶性多糖：（如当归、枸杞、大黄、艾叶等）多糖。水不溶性多糖：淀粉、纤维素等2.动物多糖：为水溶性粘多糖。肝素、硫酸软骨素、透明质酸、猪胎盘脂多糖等3.微生物多糖：香菇、茯苓、银耳等的多糖4.海洋生物多糖：甲壳素、螺旋藻多糖等。,19,（二）多糖（生理功能）分类1.贮存多糖：淀粉、糖原（供能用）2.结构多糖：具有硬性和韧性，支撑组织。几丁质（甲壳素）、纤维素,1.均一多糖：同聚多糖，单一单糖组成。homopolysaccharide淀粉、糖原、糖胶类、几丁质等。2.不均一多糖：杂聚多糖，由不同类型单糖缩合而成heterpolysaccharide肝素、透明质酸、植物中的多糖3.粘多糖(糖胺聚糖)mucopolysaccharide,glycosaminoglycan含氮的不均一多糖，通常为糖醛酸及氨基己糖或其衍生物，有的含有硫酸。透明质酸，肝素，硫酸软骨素,（三）多糖（组成成分）分类,（1）糖蛋白glycoproteins：糖与蛋白质共价结合的复合分子,糖少于Pr连接方式：1）O连接：与AA(ser,thr,Hlys）OH连接为糖苷2）N连接：与Aln的酰胺基连接常见的糖蛋白：人红细胞膜糖蛋白、血浆糖蛋白、粘液糖蛋白等。（2）蛋白聚糖proteoglycan：糖胺聚糖链共价连接于核心蛋白组成，多、复杂。软骨蛋白聚糖、动脉蛋白聚糖、角膜蛋白聚糖,4.结合糖：糖复合物glycoconjugate,22,（3）糖脂：glycolipids糖类通过其还原端以糖苷键与脂类连接的化合物各种衍生糖脂（鞘糖脂、甘油糖脂、磷酸多萜醇衍生的糖脂、类固醇衍生的糖脂）（4）脂多糖Lipopolysaccharide；糖为主体的糖脂复合物。胎盘脂多糖、细菌脂多糖等,二、重要多糖的化学结构与生理功能,（一）淀粉starch：植物多糖，存在于种子、块根与果实中，大米淀粉达70%80%。天然淀粉：-D-葡萄糖的同聚多糖直链淀粉：-1，4糖苷键直链结构，空间结构为空心螺旋状，6个葡萄糖单位/圈螺旋支链淀粉：-1，4糖苷键形成多个较短的分子，其之间连接键为-1，6糖苷键（糯米含支链淀粉比例高（几乎达100%），粘稠）,淀粉的性质：冷水中不溶解，加热淀粉膨胀成糊状。碘反应：直链-兰色支链-紫红色淀粉水解与碘反应：淀粉大小不一多糖（糊精）淀粉糊精红糊精无色糊精麦芽糖G碘反应：兰色红色无色,（二）糖原glycogen动物淀粉（肝、肌肉）-D-葡萄糖构成的同聚多糖与支链淀粉相似，为带有-1，6分支点的-1，4-葡萄糖多聚物，但分支多（短链约含810个葡萄糖单位）。遇碘产生红色，彻底水解产生D-葡萄糖（三）葡聚糖dextran（右旋糖酐）酵母菌及其某些细菌的储存多糖主要为-1，6-葡萄糖同聚多糖（偶有-1，2，-1，3，-1，4连接）,26,（四）纤维素cellulose植物胞壁成分。结构：D-葡萄糖以-1,4-糖苷键连接的直链同聚多糖,不溶于水、稀酸及稀碱（-1,4键对酸较强抵抗力），强酸水解产生D-葡萄糖及纤维二糖。哺乳动物无-1，4糖苷键的水解酶，反刍动物（牛羊）消化道细菌存在水解纤维素的酶。,27,反应：成酯：纤维素中葡萄糖的自由羟基与酸成酯纤维素与浓硝酸-硝化纤维素（酯）,医药化学工业原料（火棉胶，炸药原料）纤维素与醋酸成醋酸纤维素：多种塑料的原料，生化试剂等。,28,琼胶能吸水膨胀，不溶于冷水，但可热水成溶胶，冷却后成凝胶。不易被细菌分解，所以作细菌培养基的凝固剂.,D-半乳糖（9个D-半乳糖单位以-1，3-糖苷键连接）与L-半乳糖以1,4-糖苷键相连,L-半乳糖C6结合一硫酸基.,结构：,（五）琼胶agar琼脂（海藻多糖）,29,(六)几丁质chitin（甲壳素或壳多糖）,组成：N-乙酰氨基葡萄糖通过-1，4糖苷键连接起来的同聚多糖。为医药、化工及食品行业辅料,虾蟹昆虫夹壳的主要成分、植物、菌类藻类植物细胞壁亦含有。其量仅次于纤维素,（七）黏多糖1，透明质酸hyaluronicacid组成：D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖交替组成线性结构(以-1,3糖苷键连接成二糖单位,再以-1,4糖苷键同另一二糖单位连接）.,存在于动物的结缔组织、眼球的玻璃体、角膜、关节液中。具强吸水性，形成粘度很大胶状液，具黏结与保护细胞的作用。透明质酸酶（细菌、蜂毒）水解透明质酸（异物侵入或药物扩散）,31,2.硫酸软骨素chondroitinsulfate体内最多的黏多糖,为软骨主要成分结构:二糖的聚合物(ABC三种)A:葡萄糖醛酸-1,3-N-乙酰氨基半乳糖-4-硫酸酯B:艾杜糖醛酸-1,3-N-乙酰氨基半乳糖-4-硫酸酯C:葡萄糖醛酸-1,3-N-乙酰氨基半乳糖-6-硫酸酯硫酸软骨素B-硫酸皮肤素(存在于皮肤的黏多糖)降血脂和缓和的抗凝血作用。,32,3.肝素heparin存在于肝、肺、血管壁、肠粘膜中天然抗凝血物质组成:硫酸氨基葡萄糖,葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸的硫酸酯。氨基葡萄糖苷为型，糖醛酸糖苷为型。肝素中为四糖重复单位。,33,（八）细菌多糖,1，肽聚糖peptidoglycan又称胞壁质murein,构成细菌细胞壁基本骨架的主要成分结构：多糖与氨基酸链相连的多糖复合物,结构中糖以-1,4键连接成二糖重复单位.AA为D-AA。形成的聚合物肽聚糖DAA肽有抵抗肽水解酶的作用，故对细菌细胞有保护作用。溶菌酶水解肽聚糖结构中1,4糖苷键，而导致细菌细胞膨胀破裂。（该酶溶解革兰氏阳性菌机制）青霉素抗菌作用：抑制肽聚糖的生物合成，使得细胞壁不完整，从而导致细菌死亡。,34,2.脂多糖,革兰氏阴性菌除含有10%肽聚糖外，含有十分复杂的脂多糖。组成：外层低聚糖链；核心多糖；及脂质。细菌脂多糖的外层低聚糖是使人致病的部分（单糖组分随菌株而不相同），各种菌核心多糖链均相似。,35,36,三、多糖提取、分离和纯化的原理,（一）多糖的提取与分离(来源不同，提取方法各异)第一类难溶于水，可溶于稀碱液。主要是胶类，如木聚糖、半乳聚糖原料粉碎后用0.5mol/LNaOH水溶液提取，后中和、浓缩，最后加入乙醇，得粗糖沉淀物第二类易溶于温水，难溶于冷水的多糖。可用7080C热水抽提，提取液用氯仿：正丁醇（4:1)混合去蛋白质，经透析，浓缩后再加入乙醇即得粗多糖产物,37,第三类黏多糖的提取（组织中黏多糖与蛋白质共价结合）用蛋白酶水解蛋白或用碱处理，使之间共价键断裂，促使粘多糖释放，以便于提取。(1)碱液抽提法：原料经预处理后，用0.5mol/LNaOH溶液于4C提取，酸中和。蛋白质用调节pH、加热或用白陶土吸附去除。最后以乙醇沉淀即可获成品。软骨中提取软骨素即用此法。(2)蛋白水解酶消化法组织中释出粘多糖的方法蛋白水解酶：木瓜蛋白酶及链霉蛋白酶经酶消化的提取液用5%三氯醋酸去蛋白或透析，乙醇沉淀粘多糖。,38,（二）多糖的纯化：方法多，根据条件适当选择，多种方法同时使用以达到理想的分离结果1.分级沉淀法：乙醇分级沉淀分离各种硫酸软骨素。2.季铵盐络合法：表面活化剂与粘多糖聚阴离子形成络合物，水不溶(低离子强度）。3.离子交换层析：利用pH及盐浓度梯度分离各种多糖4.制备性区带电泳：利用分子大小、形状、电荷区分5.固定化凝集素的亲和层析法：特异结合单糖和寡糖（可逆）如刀豆凝集素ConA专一与甘露糖基结合。,39,（三）多糖的降解1.化学降解法：常用亚硝酸控制降解法。污染2.酶法降解：特异性强。产量低，成本高3.辐射降解法：使分子电离或激发，分子间形成化学键辐射交联，导致分子链断裂辐射降解。,四、多糖理化性质测定,（一）多糖的含量测定：方法多种硫酸蒽酮法（己糖基、戊醛糖、己糖醛酸）蓝绿色，620nm苯酚-硫酸法：多糖在硫酸作用下水解成单糖，并脱水生成糖醛衍生物，再与苯酚生成橙黄色化合物。比色法测定。硫酸卡唑法（糖醛酸）乙酰丙酮显色法（氨基葡萄糖）（二）多糖纯度测定1.电泳法（高压电泳）2.凝胶柱层析法：呈现一个峰为标准3.紫外扫描法：多糖200nm，检查是否有蛋白质、核酸。纯度4.其它方法：特殊基团，纸层析、水解后糖组分分析等,41,（三）多糖分子量测定（物理方法）1.凝胶柱层析法：已知分子量的多糖作标准2.特性黏度法:相似结构多糖决定K值，测出粘数，计算分子量（=KM2)。其它性质分析：比旋度测定、溶解度测定。,42,五、多糖的结构分析,复杂（结构与种类多有关），但迄今无一种方法可单独完成结构分析，需结合应用。物理方法：红外光谱、核磁共振谱、质谱、X射线衍射；化学方法：化学降解法、酶解法、免疫化学法和放射免疫法,43,（一）多糖组成成分的分析了解何种单糖组成及之间的比例以片段为单位分析。,1.酸水解（完全酸水解，部分酸水解）13mol/L硫酸或2mol/L三氟乙酸，80100C密闭加热68小时完全水解得到单糖；0C或室温下水解得到较低分子量的寡聚糖。水解产物用纸层析、薄层层析、气相层析等鉴定。水解测出多糖中单糖的组成，并计算各单糖成分间分子比。,44,2.乙酰解乙酐：乙酸：水（10:10:1)混合液中加热，使一定的糖苷键处断裂。（为酸水解的补充，高度裂解16糖苷键）生成乙酰化单糖和乙酰化寡糖。用层析法鉴定，从另一角度获得糖链结构信息。3.甲醇解多糖链80100C与无水甲醇氯化氢反应，使糖链变成单糖的甲基糖苷。将其转化为三甲基硅醚衍生物或乙酰基衍生物，气相层析分子（与标准对照），可得到多糖中单糖成分的定量数据,45,（二）多糖结构的甲基化分析为结构分析最有力的手段之一单糖（多糖中）（OH全部生成甲醚）（甲基化试剂）游离羟基生成甲醚，水解、释放甲基化单糖硼氢化钠还原糖醇乙酰化糖醇乙酰衍生物（气相色谱质谱分析）阐明单糖种类和比例，及连接方式（键型，糖苷键位置）。,（三）多糖结构的过碘酸氧化及Smith降解过碘酸氧化反应：一种选择性的氧化降解反应，作用于多糖分子中1,2二羟基和1,2,3-三羟基生成相应的醛或甲醛、甲酸。定量反应：高碘酸的消耗与甲醛甲酸的生成，判断糖苷键位置，直链多糖的缔合度、支链多糖的分支数目等。,47,Smith降解：将过碘酸氧化产物进行还原，进行酸水解或部分酸水解。（改良过碘酸氧化）通常在室温下用稀无机酸水解还原产物。结果得到具有特征性的糖链的重复单元，获取多糖结构信息。,48,（四）多糖结构的酶降解测定法,不同性质的糖苷酶或称多糖酶能作用于不同性质的糖苷键，通过顺序降解，阐明多糖链的一级结构。酶的来源不同，作用有差异。糖苷酶：外切糖苷酶，内切糖苷酶,49,1.外切糖苷酶：只能切下多糖非还原末端的一个单糖。对单糖组成和糖苷键有专一性。(1)-D-半乳糖苷酶(-D-galactosidase）(2)-D-半乳糖苷酶(-D-galactosidase）(3)-D-甘露糖苷酶(-D-mannosidase）(4)-D-甘露糖苷酶(-Dmannosidase)(5)-L-岩藻糖苷酶（-L-fucosidase)(6)N-乙酰-D-氨基己糖酶（N-acetyl-D-hexosaminidase)(7)N-乙酰-D-氨基半乳糖苷酶（N-acetyl-D-galactosaminidase),50,2.内切糖苷酶水解糖链内部的糖苷键，释放多糖链片段常见内切糖苷酶：(1)内切-N-乙酰-D-氨基葡萄糖酶(endo-N-acetyl-D-glucosaminidase)(2)内切-D-半乳糖苷酶(endo-D-galactosidase)(3)内切-N-乙酰-D-氨基半乳糖苷酶(endo-D-galactosaminidase)(4)肽-N-聚糖水解酶分为两类：水解糖糖之间连接键，释放片段(2)；水解单糖氨基酸或单糖多肽之间的连接键，释放完整的糖链结构。(1,4),六、糖链与糖蛋白的生物学活性,1.糖链与酶活性:糖链在酶的新生肽链折叠、转运和保护方面起作用；有些酶活性与糖链无关，有些酶活性依赖糖链的存在。2.糖链与激素:糖蛋白类激素活性（受体亲和力和半衰期）与糖链有