结构生物学的研究方法ppt课件VIP

.,电子晶体学与电镜三维重构,.,电子晶体学与电镜三维重构,概况电子显微镜的基本知识电镜三维重构的理论基础有关的实验技术应用实例,.,概况,目前广泛使用的术语方法特点膜蛋白结构测定的困难电子晶体学与X-射线晶体学的比较电子晶体学的历史结构测定的一般步骤,.,概况,目前广泛使用的术语：Electroncrystallography电子晶体学Electroncryomicroscopy低温电子显微学3-dimensionalreconstructionofelectronmicroscopy电镜三维重构Electrondiffractionandimaging电子衍射和成像,.,概况,方法特点分辨率：330，大多数达不到原子分辨率适用的样品：晶态或非晶态，复杂的大分子组装体蛋白质的二维晶体螺旋状分子复合物纤维样品单颗粒的大分子复合物（MW250kDa）病毒无相位问题，电镜像本身即包含振幅和位相信息,.,概况,膜蛋白结构测定的困难PDB统计：内在膜蛋白2003年3月58个膜蛋白难于结晶膜蛋白多是多重复合物，分子量大,.,概况,电子晶体学与X-射线晶体学的比较X-rayEM研究对象：晶体20um微小晶体与薄膜，单颗粒，螺旋纤维数据形式：衍射数据衍射数据，显微像相位问题：有无,.,概况,电子晶体学的历史20世纪30年代，原苏联的一个晶体学小组开始电子衍射的方法研究1968年Klug和DeRosier开创电子显微镜三维重构的基本原理和方法重构了T4烟草花叶病毒颗粒尾部的三维空间结构。1975年，Henderson和Unwin重构了细菌视紫红质（BR）的7分辨率的三维结构。-电子晶体学的一个里程碑。1982年，Klug因此获得诺贝尔化学奖。1990年，Henderson等人把细菌视紫红质的研究提高到了3.5分辨率，并提出了原子模型。最近十几年来，电子晶体学已经发展成为一种X射线晶体学所不可替代的生物大分子空间结构分析的有效手段。,.,概况,结构测定的一般步骤电镜样品的制备（包括蛋白质二维晶体的生长）电镜观察照相数据处理及计算机三维重构（构建原子模型）,.,电子晶体学与电镜三维重构,概况电子显微镜的基本知识电镜三维重构的理论基础有关的实验技术应用实例,.,电子显微镜的基本知识,“科学之眼”的诞生电子显微镜的分辨率透射电镜的基本工作原理,.,“科学之眼”的诞生,光的衍射效应对分辨率的限制d0.4l人眼的分辨率：0.10.2mm光学显微镜：0.10.2um寻找新的光源电子波动性的发现1924De.Broglie提出物质波理论，并被电子衍射实验证实电子透镜的发现1926年,H.Busch提出轴对称磁场可以汇聚电子束，并服从几何光学定律第一台电子显微镜的研制E.Ruska,.,电子显微镜的分辨率,电子的波长电子的速度由加速电压决定，故电子的波长与加速电压有关：（kv）l()-500.05481000.03882000.02514000.016410000.0123电子显微镜的实际分辨率：目前可达到1左右，能够看到单个原子,.,透射电镜的基本工作原理,透射电镜的外观,.,透射电镜的基本工作原理,透射电镜的内部结构电子透镜系统（镜筒）照明系统：由电子枪和聚光镜组成成象系统：包括物镜、中间镜、投影镜，有时增加一个衍射透镜。观察系统：荧光屏、光学观察放大镜及照相机。真空系统电源系统,.,透射电镜的基本工作原理,电子成象和电子衍射的基本原理电镜的三级成像系统：物镜、中间镜和投影镜。成像模式和衍射模式：电镜的两种工作模式。,.,电子晶体学与电镜三维重构,概况电子显微镜的基本知识电镜三维重构的理论基础有关的实验技术应用实例,.,电镜三维重构的理论基础,电子显微像是物体的二维投影三维重构的数学基础三维重构的原理,.,电子显微像是物体的二维投影,.,三维重构的数学基础,Radon理论1917年，Radon提出：如果已知一个物体在不同方向上的无穷多个低维投影，就可以通过Radon变换，精确地重构出高维空间的物体结构。傅里叶变换中央截面定理,.,三维重构的数学基础,中央截面定理物体的二维投影像的傅里叶变换等于物体的三维傅里叶变换中通过原点且与投影方向垂直的一个截面（中央截面）。,.,三维重构的原理,如果获得足够多的物体在各个方向的二维投影像，即可获得足够多的傅里叶空间中的中心截面，将这些中心截面按其方向组合起来，即可获得物体三维傅里叶变换的近似值，将它作傅里叶逆变换，就得到物体的三维图像。1968年，D.DeRosier和A.Klug首次提出上述三维重构思想,.,三维重构原理,.,电子晶体学与电镜三维重构,概况电子显微镜的基本知识电镜三维重构的理论基础有关的实验技术应用实例,.,有关的实验技术,蛋白质二维晶体的生长电镜样品的制备数据的收集和处理,.,蛋白质二维晶体的生长,二维晶体的特征一个连续的脂双层或脂单层膜膜上的蛋白质呈规则的周期排列有囊泡状、片状和管状等类型疏水相互作用是维系二维晶体结构的主要作用,.,蛋白质二维晶体的生长,二维晶体的生长膜蛋白二维晶体的生长（内在膜蛋白）天然膜中重排天然形成的膜晶体嗜盐菌质膜上的细菌视紫红质（BR）物理或化学因素诱导形成膜晶体负提纯技术透析法水溶性蛋白二维晶体的生长脂单层表面的二维结晶化,.,电镜样品的制备,电镜制样的器材载网：铜网支持膜：碳膜负染色技术原理及方法：用高电子密度的染色剂沉积在蛋白质分子周围，使蛋白质的电子显微像具有较高的反差（衬度）。常用的负染剂：醋酸铀特点：最常用的衬度增强技术；分辨率低，1520；样品脱水会影响蛋白质分子的结构糖包埋技术用葡萄糖等物质取代蛋白质溶液中的水介质，形成类似水的环境。包埋剂：葡萄糖、海藻糖、单宁酸等特点：可以保持生物大分子的结构；分辨率较高，理论上可达3-4,.,电镜样品的制备,冰包埋技术将样品悬液薄层高速冷冻到-160以下，冷冻速度达到106/s，使蛋白质样品处于非晶体的玻璃态冰中。常用液氮冷却特点：1）是目前最好的样品包埋方法；2）高速冷冻形成的无序冰中，样品的水合状态得以保持，样品的结构不受破坏；3）可以获得高分辨率的结构数据；4）可以降低样品的辐射损伤；,.,数据的收集和处理,显微像和电子衍射信息的获取样品的多角度照相低剂量曝光技术：聚焦和照相不在同一个样品区域低温电镜技术：电镜中样品的温度维持在-160左右数据处理照片的数字化计算机数据处理及三维重构,.,电子晶体学与电镜三维重构,概况电子显微镜的基本知识电镜三维重构的理论基础有关的实验技术应用实例,.,应用实例,DNA分子结构的研究,.,应用实例,蛋白质三维结构的测定微管蛋白的结构与功能研究