发酵嗜酸乳杆菌发酵培养基优化研究

2020/5/8,学号+姓名,嗜酸乳杆菌,xxxxxxxx,嗜酸乳杆菌-1.557发酵培养基优化研究,2020/5/8,学号+姓名,概念,嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）属于乳杆菌属，是肠道重要的益生菌，对维持胃肠道的生理功能有重要作用，被广泛用于发酵食品与医药行业。但在饲料生产和养殖业中应用报道较少，为了探讨嗜酸乳杆菌在畜牧业生产上的标准化应用，本研究以产酸能力较强的嗜酸乳杆菌-1.557菌株为试验菌，优化了其培养条件和培养基成分，给乳酸菌发酵饲料的标准化生产提供依据。,2020/5/8,学号+姓名,目录,结论最佳培养条件优化培养基成分优化培养后,结果分析静置培养和摇床培养培养基起始pH值的确定培养温度的确定接种量的确定最适培养基成分的确定嗜酸乳杆菌-1.557生长曲线,材料和方法菌种实验设备培养基培养条件优化对培养基成分的优化测定方法,2020/5/8,学号+姓名,一.材料与方法,1.1菌种酸乳杆菌1.2实验制备振荡培养箱(SHZ-A型）、生化培养箱(DHP120型)、高压灭菌器(MLS-3750型)、磁力搅拌器(JB-3型)、便携式pH计(PHB-3型)、生物洁净工作台(SA-960-2型)、721可见紫外分光光度计1.3培养基种子培养基（MRS培养改良基）：蛋白胨10g、酵母提取物5g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸铵2.15g、Tween801ml、MgSO47H2O0.58g、MnSO44H2O0.05g、K2HPO42g、琼脂粉17g、水1000ml。,2020/5/8,学号+姓名,1.4培养条件优化菌种活化：从冰箱中取出嗜酸乳杆菌-1.557斜面菌种，室温静置40min。然后从中取两环菌种接于装有10ml液体种子培养基试管中，37静止培养12h，备用。,1.4.1静置培养和摇床培养对比按1.0接种量将活化的种子接种于装有100mlMRS改良液体培养基的250ml三角瓶中，37静置培养和60r/min振荡培养48h，每隔12h取1次样(先摇匀后取样)，在610nm处（以下同）测定培养液OD值。1.4.2培养基起始pH值的筛选以6mol/l的HCl和40%NaOH溶液将MRS改良培养基的起始pH值分别调节为4.5、5.5、6.5、7.5和8.5，接入1.0活化菌液，37下恒温培养24h，测定OD值。1.4.3培养温度的筛选将100ml的MRS改良液体培养基中接入1.0的菌液，分别于30、35、40、45下恒温培养24h，测定OD值。1.4.4接种量的确定按0.5、1.0、1.5、2.0%接种量接活化菌液，37下静置培养24h，测定OD值,2020/5/8,学号+姓名,1.5对培养基成分的优化见（见表1),蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏和葡萄糖是影响培养基的主要成分。因此，本试验设计L16（45）正交试验，确定嗜酸乳杆菌-1.557最适培养基成分,1.6测定方法OD值测定采用胡俊等（2007）方法；活菌数测定参考郭兴（2002）方法。,2020/5/8,学号+姓名,二.结果与分析,2.1静置培养和摇床培养不同时间取样测定培养液OD610值，结果见表2、图1。,从表2和图1可知，试验刚开始时两种培养方法的OD610值一样，随着培养时间的延长逐渐变大，012h时间段迅速生长，1224h时间段缓慢生长，到24h时临近顶峰值，而后进入衰退期；整个培养阶段，静置培养优于摇床培养。这说明嗜酸乳杆菌-1.557的最适培养时间为24h，并且该菌是兼性厌氧菌。这符合乳酸菌多数属于厌氧菌或微好氧菌的结论。,2020/5/8,学号+姓名,2.2对培养基起始pH值的确定(见表3),从表3可以看出，嗜酸乳杆菌-1.557对酸碱环境的适应能力较强，pH值4.58.5都可以生长。当pH值小于5.5或大于7.5时生长较慢，而在pH值5.57.5范围内生长较快。pH值5.5时OD610值达到最高值1.815，即培养基的最适初始pH值为5.5。大量研究表明，乳酸菌在pH值4.58.0范围内生长良好，本试验结果在此范围内。,2020/5/8,学号+姓名,2.3培养温度的确定（见表4）,从表4可以看出，培养温度在30时OD610值为1.826，到35时提高到1.861，而超过35后，随着温度的升高OD610值有下降趋势，到45时仅为0.122。说明嗜酸乳杆菌-1.557最适培养温度为35，而且在高温条件下嗜酸乳杆菌-1.557基本不生长。单春乔等（2009）对嗜酸乳杆菌SR-1菌株分泌类细菌素的最适培养条件进行了优化研究，该菌株适宜温度为37。奚灏锵等（2009）研究结果说明其保存的嗜酸乳杆菌适宜温度为36。熊素玉等（2006）用改良MC培养基为载体，做了分离到的24株乳酸菌最适条件研究，发现最适生长温度大概在40左右，但温度的范围在各菌株间略有差异。,2020/5/8,学号+姓名,2.4接种量的确定（见表5）,从表5可以看出，随着接种量的增加，OD610值也逐渐变大。当接种量为0.5%时OD610值为1.319；接种量为1.0%时OD610值提高到1.812，有明显升高。而1.0、1.5、2.0%的接种量菌液OD610值差异不明显，从生产成本考虑本次试验采用了1.0%的接种量。李剑芳等（2003）通过正交设计试验确定最优发酵条件是乳酸菌接种量为1%；邵亚东等（2007）为制备高浓度乳酸菌发酵剂，用1%接种量可以使乳酸菌活菌数的对数值达到89。,2020/5/8,学号+姓名,2.5最适培养基成分的确定（见表6）,2020/5/8,学号+姓名,2.5最适培养基成分的确定（见表6）,从表6可以看出，在最佳条件（温度35，时间24h，接种量为1.0%）下，组合A1B4C4D4（蛋白胨6g、酵母提取物6g、牛肉膏12g、葡萄糖22g）测出的OD610值最大，即1.870。但经过统计分析得出，嗜酸乳杆菌-1.557最佳培养基成分组合为A3B4C4D1（蛋白胨10g、酵母提取物6g、牛肉膏12g、葡萄糖16g）。因为该理论条件下的组合不在实际操作组合，所以需要再进行一次验证试验。试验结果表明，A3B4C4D1组OD610值为1.889，大于A1B4C4D4组合OD610值（1.870），即嗜酸乳杆菌-1.557最适生长培养基成分为蛋白胨10g、酵母提取物6g、牛肉膏12g、葡萄糖16g，影响因素次序为酵母提取物牛肉膏蛋白胨葡萄糖。,2020/5/8,学号+姓名,2.6嗜酸乳杆菌-1.557生长曲线(见表7和图2),2020/5/8,学号+姓名,2.6嗜酸乳杆菌-1.557生长曲线(见表7和图2),从表7和图2可知，随着培养时间的延长，菌液OD值和活菌数都得到提高。当培养24h时，菌液OD值达到1.889，活菌数达2.91010cfu/ml。奚灏锵等对一株嗜酸乳杆菌进行优化研究，活菌数也达到了1010cfu/ml，与本试验结果相符。在生产菌种和乳酸菌制剂时，菌液中乳酸菌数量的多少直接影响到产品的总体质量。乳酸菌菌体小，在光学显微镜下不易直接计数，大多数采用平板涂布培养法。而平板涂布培养法培养的时间较长，不适于生产中应用，所以，平板涂布培养法可以用于终端产品的检测，但对生产过程的监控起不到作用。制作嗜酸乳杆菌-1.557生长标准曲线，采用分光光度计测定OD值，简单方便，可以随时取样检测培养液活菌数，对生产进行全过程监控，随时调整培养条件，为保证产品质量具有重要意义。,2020/5/8,学号+姓名,三.结论,3.1嗜酸乳杆菌-1.557最佳培养条件为：温度35、培养时间24h、接种量1.0%、培养基起始pH值5.5。3.2优化培养基成分为蛋白胨10g、酵母提取物6g、牛肉膏12g、葡萄糖16g、乙酸钠5g、