凝集素和免疫组化

1,第九章.凝集素组化和免疫组化(LectinHistochemistryandImmunohistochemistry)一.凝集素简介A.是一类非免疫源性,能与糖结合的蛋白质或糖蛋白,来源广泛,易于提取.B.可用荧光素,酶,生物素和胶体金等标记.C.虽不是抗体,但却可以特异性地与糖基结合,从而区分细胞亚群和与糖表达有关的细胞行为.,2,凝集素来源亚基数单糖特异性ConA刀豆4甘露糖WGA麦芽2N-乙酰葡糖胺BSA-I西非单叶豆4半乳糖DBA双花扁豆4N-乙酰半乳糖PHA菜豆4N-乙酰半乳糖UEA-I荆豆？岩藻糖PNA花生4半乳糖RCA-I蓖麻4半乳糖,3,D.特性:1.结构:218亚基聚合体.2.糖基-凝集素复合物:a.多价:每个亚基至少有一个结合位点,可结合多个单糖.b.pH依赖性:酸性pH可使凝集素分解成亚基或单体.c.受离子影响:Ca2+,Mg2+和Mn2+等可保持其结合活性.d.可逆:特定的单糖使复合物分离.,单糖解聚凝集素-糖复合物.,4,二.基本原理与条件A.基本原理:凝集素特异性结合于组织后,通过组化或免疫组化使凝集素在镜下可见.1.直接法:将凝集素用荧光物质,酶或胶体金标记后,直接作用于组织.2.抗体法:凝集素不标记,结合于组织后添加抗凝集素抗体.该抗体可为标记抗体.若为非标记抗体,再继续用标记二抗或PAP法完成染色.3.生物素法:用生物素标记凝集素后作用于组织,再用标记的抗生物素蛋白或ABC复合物与生物素作用.4.糖-凝集素-糖夹层法:形成组织中的糖-凝集素-糖基化标记物.,5,B.条件:1.组织制备:新鲜,未经处理的组织最理想.2.暴露糖基:蛋白水解酶消化切片,增加检出机会.3.加入蛋白质:加入不含糖基的蛋白质如0.110%牛血清白蛋白(BSA)可以使凝集素稳定,并减弱非特异性染色.4.缓冲液:TBS,pH7.4,常加入少量多种2价金属离子：Tris6.08gNaCl8.7gDDH2O加至100ml,并用HCl调pH至7.4,再加入1%CaCl21.5ml1%MnCl22ml1%MgCl22ml(后三者的终浓度为1mM),6,四.直接法A.原理:将FITC,HRP或胶体金标记的凝集素直接用于组织.,B.方法:1.冰冻切片,空气干燥(经或不经丙酮或甲醇固定);或石蜡切片,脱蜡至水.缓冲液洗.2.100g/ml标记凝集素室温30分.缓冲液洗.3.封片,荧光(FITC)或普通LM(胶体金)观察;或0.05%DAB-0.01%H2O2显色(HRP).4.脱水,透明,封片.,7,胃壁细胞EM观察HRP标记的双花扁豆凝集素(DBA)染色,8,五.抗体法A.原理:将组织切片孵育于凝集素溶液,使之结合于切片上的糖链,清洗后加凝集素的特异性抗体.该抗体可用FITC,HRP或胶体金标记;也可不标记凝集素抗体,而将二抗标记;或使用未标记二抗,再用PAP复合物完成染色.,9,B.方法:1.标记一体法:a.石蜡切片,脱蜡至水.b.3%H2O210分,抑制内源性酶(针对酶标记).缓冲液洗.c.10g/ml未标记的凝集素室温30分.缓冲液洗.d.1:100(抗血清)或10g/ml(IgG)标记的抗凝集素抗体30分.缓冲液洗如上.e.镜检或0.05%DAB-0.01%H2O2显色后镜检.,10,2.标记二抗法:a.前5步同1.b.未标记的凝集素抗体,1:100或10g/ml,30分.缓冲液洗.c.标记的二抗,1:50100,30分.缓冲液洗.d.镜检或DAB-H2O2显色后镜检.3.PAP法:a.前7步同2.b.未标记的二抗,1:50100,30分.缓冲液洗.c.PAP复合物,1:50100,30分.缓冲液洗.d.0.05%DAB-0.01%H2O2显色后镜检.,11,六.生物素法:A.原理:将凝集素用生物素标记,作用于组织切片上的糖基,然后加用标记的抗生物素蛋白,或ABC复合物,使之与生物素结合,从而将标记物引入到凝集素结合的组织部位.,12,B.方法:1.石蜡切片,脱蜡至水.2.0.1%胰蛋白酶(含0.1%CaCl2),371030分.缓冲液洗.3.3%H2O210分,封闭内源性酶.缓冲液洗.4.生物素标记的凝集素210g/ml,3060分.缓冲液洗.5.标记抗生物素蛋白,110g/ml,30分;或ABC复合物,3060分.缓冲液洗.6.荧光显微镜观察(荧光标记),或0.05%DAB-0.01%H2O2显色后普通光镜观察(酶标或ABC复合物).,13,胃壁细胞和上皮光镜观察生物素标记的双花扁豆凝集素(DBA)和蓖麻凝集素(RCA)染色,14,七.糖-凝集素-糖夹层法A.原理:将过量凝集素加于组织切片上(以保证凝集素的结合位点被组织上的糖基不完全占据),再加糖基化的标记物(如岩藻糖基Fuc-HRP),其中的糖基将结合于未被占据的凝集素结合位点,然后显示标记物.由于目前发现的糖基化的标记物种类不多,故夹层法的使用有限.,15,糖基化HRP的凝集素结合特性糖基化HRP糖基凝集素HRP(未处理)ManConA,LCA,PSA半乳糖基-HRPGalPNA,SBA,RCA岩藻糖基-HRPFucUEA-I,LTA甲壳乙糖基-HRPGlcNAcWGA,UEA-II,B.方法:1.石蜡切片脱蜡至水.2.3%H2O210分,封闭内源性酶(针对酶标记).缓冲液洗.3.1020g/ml凝集素如ConA30分,缓冲液洗.4.20g/ml糖基化标志物如Fuc-HRP,3060分.缓冲液洗.5.显示标记物(例如用0.05%DAB-0.01%H2O2显示HRP活性).,16,八.EM凝集素法:在EM中常用HRP和胶体金作为标记物.包埋前染色显示细胞表面,包埋后染色显示细胞内的糖结合物.A.包埋前染色:1.直接法:a.细胞悬浮固定于2.5%多聚甲醛中4小时.离心细胞,缓冲液洗.b.0.2M甘氨酸-TBS洗15分.离心细胞,缓冲液洗.c.金标凝集素10g/ml室温12小时.离心细胞,缓冲液洗.d.包埋,超薄切片.2.间接法:细胞经预处理后,以未标记凝集素(10g/ml)处理,然后以该凝集素的特异性抗体和金标蛋白A相继处理;或用糖-凝集素-糖夹层法;也可用生物素标记凝集素加于细胞,再用金标抗生物素蛋白处理.,17,B.包埋后染色:以直接法为例.1.细胞或组织固定于2%,戊二醛过夜.2.常规或低温包埋,超薄切片.3.将载有切片的镍网漂浮于1滴0.05mMNH4Cl溶液上,15分.缓冲液洗.4.TBS-BSA处理.5.将镍网置1滴金标凝集素溶液上(10g/ml),12小时,室温.6.双蒸水喷洗,干燥后铀-铅染色,观察.,18,九.对照试验A.阳性对照:证明凝集素及所用各种染色试剂和染色方法都是有效的.1.凝集素凝集对照:大多数凝集素都能与红细胞结合(与血型物质特异性结合或非特异性结合.2.组织对照:组织切片上的红细胞和血管内皮细胞常被各种凝集素染色.,19,B.阴性对照:检查染色的特异性和单糖特异性.前者指染色是否由凝集素引起,后者指染色是否由某单糖(或含某单糖的寡糖)所引起.1.在直接法中,使用标记凝集素之前,以过量未标记凝集素(1mg/ml,30分)封闭组织中的结合位点.2.在间接法中,从染色程序中省去凝集素.3.在糖-凝集素-糖夹层法中,在凝集素与标记糖蛋白之间加用未标记糖蛋白