科研英文文献汇报英文--MicroRNAPPT课件

-,1,MicroRNA-224promotestumorprogressioninnonsmallcelllungcancer,汇报人：李婷,MiR-224促进非小细胞肺癌肿瘤形成,-,2,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,目录Contents,introduction,Others,MethodsResults,Discussion,-,3,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,Results,Conclusion,Methods,在全世界，肺癌是癌症相关性疾病中主要的致病因。尽管手术及药物治疗水平有所提高，肺癌患者的生存率依然极低。总体来说，分期较早的非小细胞肺癌患者，无论是手术还是非手术患者均得到了控制。然而，非小细胞肺癌导致局部及远处转移的分子机制尚不清楚。在非小细胞肺癌组织中，我们证实了microRNA-224(miR-224)显著上调，尤其发生转移的组织中。增加miR-224表达水平，其通过以抑癌物质TNF-inducedprotein1(TNFAIP1)（肿瘤坏死因子介导蛋白1）及SMAD4为靶点，从而促进了细胞的迁移，侵袭及增殖。与体外实验一致，裸鼠异体移植实验也证实了miR-224在体内非小细胞肺癌中作为强力致癌的miRNA。同时，我们还发现了在非小细胞肺癌中，启动子甲基化及ERK信号参与调节miR-224的表达。上调的miR-224通过拮抗SMAD4及SMAD4的抑制作用，从而增强非小细胞肺癌的形成及肿瘤侵袭性。,-,4,全基因组miRNA测序,miR-224,低甲基化探针,相关分析,miR-224与启动子甲基化的关系,相关分析及细胞系佛脂醇治疗,启动子低甲基化及激活的ERK信号通路介导miR-224的表达,-,5,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,Results,Conclusion,Methods,非小细胞肺癌NSCLC（nonsmallcellLungcancer）,非小细胞型肺癌包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢,扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%，约75%的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。,MicroRNAs（miRNAs）,是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约2025个核苷酸通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译，参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、器官形成、细胞增殖和凋亡等。,TNFAIP1（TNF-inducedprotein1）,肿瘤坏死因子-（TumorNecrosisFactor，简写TNF）是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子。而肿瘤坏死因子介导蛋白1涉及DNA合成及凋亡.,SMAD4,Smads家族蛋白在将TGF-(转化生长因子)信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用。按功能分为3类：即受体活化型或通路限制性Smad(RSmads)、共同通路型Smad(CoSmad)和抑制性Smad(ISmads)。,-,6,Results,miR-224上调在非小细胞肺癌中的功能,-,7,全基因组miRNA测序,倍数变化的miRNAmiR-224,技术路线,肺癌中miR-224的表达水平及是否与转移有关,观察肿瘤体积及镜下改变,-,8,4例伴淋巴结转移的肺腺癌,6例不伴淋巴结转移的肺腺癌,genome-widemiRNAsequencing,-,9,87例NSCLC,48例NAT(正常),在ADC及SCC中，miR-224明显上调,OhioStateUniversityComprehensiveCancerCenter(OSUCCC)俄亥俄州立大学综合癌症中心,-,10,666例ADC及SCC,86例NAT,相较于NATs，miR-224在ADC及SCC中明显上调,Oftheevaluable468primarylungADCpatients,46patientshadmatchednormaladjacenttissues.Oftheevaluable198primarylungsquamouscarcinomapatients,40patientshadmatchednormaladjacenttissues.,TheCancerGenomeAtlas(TCGA)癌症和肿瘤基因图谱,-,11,明确分期281例ADCN0,143例ADCN1+,伴淋巴结转移的患者中，miR-224明显上调,miR-224expressionin281N0patientsversus143N1+patientsfromTCGAlungADCdataset,-,12,NSCLC,NATs,miR-224在61%的病例中过表达,51例配对,原位分子杂交,在有转移的肺癌中，miR-224表达更强,miR-224可能在有转移的肺癌中起到重要作用,Summaryoftissuemicroarraydataforlungcancerandcorrespondingnormaltissue.PairedanalysisrepresentssubtractionofNATstainingscorefrommatchedlungcancertissuescores.,-,13,miR-224表达与生存之间并无明显联系,642例NSCLC,KaplanMeier生存分析,TCGA,-,14,miR-224与有(kras)/p53突变肺腺癌患者的不良预后明显相关,59例ADC,KaplanMeier生存分析,同样地在有(kras)/p53突变肺腺癌患者中，相较N0组，可观察到N1+组的miR-224expression表达上调，,miR-224expressionin31N0patientsversus26N1+patientsfromlungADCpatientswhohaveTP53and/orKRASmutations.,-,15,H1299H1573H460,miR-224过表达,转染含miR-224前体的Lenti-miR载体,A549,miR-224下调,转染含miRZip-224antimiR-224结构的载体,-,16,miR-224过表达,H1299andH1573细胞的迁移，侵袭及增殖明显增加,CellmigrationassayformiR-224overexpressingH1299andH1573cellsusingtranswellmembranes,CellinvasionassayformiR-224overexpressingH1299andH1573cells,CellproliferationassayformiR-224overexpressinglungcancercells,-,17,迁移细胞计数,-,18,A549,migrationassayformiR-224knockdownA549cells,CellproliferationassayformiR-224knockdownA549cells,MigratedcellcountsafterknockdownmiR-224inA549cells.,-,19,H460/miR-224,对照组细胞系或A549/miRZip224,皮下注射至裸鼠侧面,相较于对照组细胞，过表达miR-224的H460细胞系显著增加了体内的肿瘤增长,-,20,下调A549细胞中的miR-224,皮下注射至裸鼠侧面,肿瘤体积减少,在肺癌中miR-224作为致癌miRNA.,-,21,镜下,-,22,Results,miR-224以TNFAIP1及SMAD4的3端为靶点,-,23,技术路线,-,24,3-UTRs的荧光信号持续性减低,3-UTRsmiR-224mimics,293Tcells,共转染,miR-2243-UTRs的突变形式,野生型3-UTRs的荧光信号持续性减低的趋势减弱,野生型的及突变的TNFAIP1andSMAD43-UTRs与withmiR-224mimic共转染至293T细胞,miRNAand3-UTRs靶点的特异性.,-,25,在H1299,H1573,和H460细胞系中，mRNAand蛋白质的TNFAIP1andSMAD4表达减少,过表达miR-224,WesternblotandquantitativeRT-PCR检测转染了表达miR-224前体的及对照载体的肺癌胞中，TNFAIP1及SMAD4蛋白及mRNA水平,-,26,在A549细胞中，TNFAIP1及SMAD4mRNA蛋白质水平表达增加,下调miR-224,WesternblotandquantitativeRT-PCR检测转染了表达下调miR-224的及对照载体的肺癌胞中，TNFAIP1及SMAD4蛋白及mRNA水平,检测miR-224对靶蛋白及靶mRNA的影响,-,27,TNFAIP1(P=4.9E-15)andSMAD4(P=2.2E-16)表达显著降低,TNFAIP1和SMAD4表达降低原发性肺鳞癌组织,TNFAIP1和SMAD4减少.,334ADC&57NATs,349SSC&51NATs,TCGAdataset,-,28,NSCLC中TNFAIP1(5.23E-14)andSMAD4(2.67E-06)的表达下降,TNFAIP1andSMAD4expressionsin63NSCLCpatientswith48matchedNATsfromOSUcohort,63例NSCLC&48NATs,-,29,111例NSCLCOSU,306例NSCLCTGGA,Pearson相关分析,miR-224与TNFAIP1andSMAD4呈负相关,OSUcohort,TCGA,-,30,TNFAIP1下调,增加H460的迁移及增值能力,knockdownH460cellsusingtranswellmembranes,migrationassayforTNFAIP1,forTNFAIP1knockdownH460lungcancercells.,Cellproliferationassay,Westernblotanalyses,cellmigrationassay,-,31,TNFAIP1下调,增加H1299的迁移及增值能力,CellproliferationassayforTNFAIP1knockdownH1299lungcancercells,CellmigrationassayforTNFAIP1knockdownH1299cellsusingtranswellmembranes,-,32,在用TNF治疗后，相较H1299/miRCont细胞，H1299/miR-224细胞中poly(ADP-ribose)polymerase1(PARP1)表达水平减少,WesternblotanalysisH1299/miR-224andH1299/miRContcells用及不用TNF处理4h,CellproliferationassayforH1299/miR-224andH1299/miRContcells用及不用TNF处理4h.,在H1299细胞中，miR-224明显减缓TNF介导的生长抑制,miR-224通过以肺癌中的TNFAIP1为靶点参与TNF介导的凋亡,-,33,稳定过表达miR-224的肺癌细胞中转染SMAD4,H1299andH1573肺癌细胞中均减弱了介导的增加增殖及迁移的能力,proliferationassayandmigrationassayofmiR-224overexpressingcellstransfectedwithSMAD4oremptyvector,WesternblotanalysisofmiR-224overexpressingcellstransfectedwithSMAD4(donotcontain3UTR)oremptyvector,cellmigrationassayformiR-224overexpressingcellstransfectedwithSMAD4oremptyvector,-,34,用TGF-处理miR-224过表达组及对照组细胞,在H460细胞中，miR-224明显损害了TGF-介导的SMAD4细胞核转录作用miR-224明显减弱了TGF-介导的对细胞生长及迁移能力的抑制作用,miR-224以SMAD4为靶点在TGF-信号通路中起到重要作用,-,35,Results,启动子低甲基化及激活的ERK信号通路介导miR-224的表达,-,36,技术路线,-,37,miR-224,miR-452及GABRE的标准化表达值从TCGA数据库中提取出并进行Pearson相关分析,miRNA表达受表观遗传修饰及转录激活控制。miR-224andmiR-452位于宿主基因-AminobutyricAcidAReceptor(GABRE)内显子5上，并且GABRE启动子区域有CpG岛,图式结构显示miR224miR452GABRE的基因位点。miR-224andmiR452位于GABRE的6内显子.TSSi显示假定的转录位点。黑色区域显示CpG岛延伸到GABRE的外显子1,正相关,这三个基因受相同的启动子调节,-,38,选择位于CpG岛位于启动子区域的9个甲基化探针,Pearson相关分析,ADC(n=221)SCC(n=125),8个探针均显示在NSCLC中与miR-224表达的负相关,miR-224andmethylationprobecg27049053in(A)lungADCand(B)SCC.,启动子甲基化在抑制miR-224转录中起重要作用,-,39,甲基化特异高分标率溶解分析,469NAT489NATA549H647,469NAT及485NAT细胞1030%甲基化，两个肺癌细胞系中0%甲基化,meltingcurvesfromeachcellline-green,standardmeltingcurves-orange,-,40,重硫酸盐序列,469NAT489NAT,证实了正常肺组织中每个CpG甲基化水平,用脱甲基化试剂5-aza-CdR处理3天,miR-224表达水平增加,非小细胞肺癌中，miR-224启动子相关CpG岛的低甲基化水平的部分原因是由于肺癌中的miR-224高表达。,-,41,前期研究,我们观察到一个趋势：相较野生型的肺癌细胞系，有RAS突变的肺癌细胞系中miR-224的表达更高。,-,42,总ERK2蛋白与miR-224表达水平之间存在显著正相关,-,43,相较不使用佛化醇治疗的肺癌细胞系，使用佛脂醇的细胞系中miR-224的表达均明显上调,A549,H460,-,44,包含miR-224启动区域的荧光素酶显著增加了荧光素酶活性，在PMA治疗后更加明显,miR-224可能被ERK信号通路调控,-,45,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,目录Contents,introduction,Others,MethodsResults,Discussion,-,46,Discussion,大多数的人类恶性肿瘤均与异常表达的miRNA有关，有一部分miRNA作为致癌因子，另一部分作为抑癌因子。大多数报道指出，包括肝细胞癌，结直肠癌，乳腺癌等在内的实体瘤均与miR-224的上调有关,最近有研究显示，miR-224在非小细胞肺癌中具有致癌的生物学价值。,-,47,KaplanMeier生存分析显示miR-224表达与非小细胞肺癌生存率并无显著联系，可能由于分期不同，接受治疗不同。,亚组分析指出miR-224与有kras/p53基因突变的ADC患者预后差有关,miR-224作为致癌的miRNA，通过以TNFAIP1andSMAD4为靶点促进癌细胞的迁徙，增殖及侵袭,TNFAIP1在ADC及SCC中明显下调，并且，miR-224与非小细胞肺癌中的TNFAIP1水平呈明显负相关。miR-224通过以TNFAIP1为靶点，减弱了由TNF介导的细胞生长抑制作用。,Discussion,-,48,SMAD4的缺失对TGF-的信号活化起到重要作用，非小细胞肺癌的异常的SMAD4表达机制尚未明确。在非小细胞肺癌中，SMAD4的缺失可能归因于miR-224的异常表达。我们观察到，与正常组织相比，非小细胞肺癌中的SMAD4呈现出下调，并且与miR-224呈明显负相关。肺癌细胞中，过表达的SMAD4明显减弱了miR-224介导的增殖和迁徙，且miR-224通过抑制细胞核内的SMAD4转录从而参与TGF-信号通路。,综上，我们实验指出miR-224介导的TNFAIP1及SMAD4减少是由于非小细胞肺癌的侵袭和过程。,Discussion,-,49,miR-224的启动子区域有CpG岛，我们假设miR-224的表达可能涉及启动子甲基化。为了验证，我们采用了MS-HRM分析及重硫酸盐序列方法，在正常肺组织中发现了甲基化，而在两个肺癌细胞系中并未发现。探针cg27049053在肺鳞癌及肺腺癌中的甲基化与miR-224呈明显负相关。此外，用5-aza-CdR治疗后的肺非正常组织显著修复了miR-224表达。,miR-224的上调表达可能是由于miR-224启动子的甲基化,Discussion,-,50,KRAS基因在肺鳞癌中很常见，为验证ERK信号通路的活化状态是否与miR-224的表达增加有关，我们通过萤光素酶报告发现由miR-224启动子载体诱发的活化ERK信号通路的荧光信号增强。而敲除c-Jun显著减少了miR-2