第七章微生物生长和控制

第七章微生物的生长与控制,生命个体重量的增加和体积的增大,生长,生命个体数目的增加,繁殖,群体中个体数目的增加。可以用重量、数量、浓度等来衡量。,群体生长,群体生长=个体生长+个体繁殖,第一节微生物纯培养的分离方法,纯培养(pureculture):在实验条件下由一个细胞经培养繁殖而得到的后代。,平板划线分离法（StreakPlate）,特点：快速、方便。分区划线（适用于浓度较大的样品）连续划线（适用于浓度较小的样品）,稀释平板法（SpreadPlate）,应用广泛，适合于各大类微生物的分离,单孢子或单细胞分离法,采用显微分离技术从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。,选择性培养分离法,利用选择培养基进行直接分离Ashby培养基、Martin培养、高氏1号等。富集培养方法一：可利用该分离对象对某种营养物有特殊“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物。如加入纤维素、石蜡油、较浓的糖液等来富集相应的M。方法二：利用该分离对象对某种抑菌物质所特有的抗性，而使其大量繁殖。如加入抗生素。同时用于选择性的其他理化因子还有温度、氧、pH、渗透压等。,第二节微生物生长繁殖的测定,测定目的：评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；客观地反映微生物生长的规律；,个体计数法,直接法,间接法,血球计数板法,涂片染色法,平板菌落数法,薄膜过滤计数法,比浊法,重量法,生理指标法,直接法-血球计数板法,1.个体计数法,1,适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，较透明；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。特点：快速，准确；不易区分死菌和活菌。解决方法：用美蓝液对酵母菌染色后，其活细胞为无色，而死细胞则为蓝色,直接法-涂片染色法,应用：适于土壤、牛奶中细菌计数。方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取0.1ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代入公式：每ml原菌液含菌数=视野中平均菌数涂布面积/视野面积10稀释倍数,间接法-平板菌落计数法,原理：每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。,特点：最为常用,只计活菌数，但操作较烦琐且要求操作者技术熟练。改进技术：现在已出现多种微型、快速、商品化的用于菌落计数的密封琼脂板。原理是利用活菌批示剂TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑)，它可使菌落在很微小时就染成易于辨认的玫瑰红色。,常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。,间接法-薄膜过滤计数法,原理:在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。,特点：快速、简便；但易受干扰。,间接法-比浊法,测定范围：多细胞及丝状真菌的生长,将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105、100或80)、称重。（微生物的干重一般为其湿重的1020%）,2.重量法,测含氮量蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。,3.生理指标测定法,第三节微生物的生长规律,一、单细胞微生物的群体生长规律,生长曲线(growthcurve):定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线.方法:将少量细菌的纯培养体接种到恒容积的液体培养基中,在适宜的条件下培养,定期测定菌体数量,以培养时间为横坐标，以菌数对数为纵坐标，作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。,按照生长速率常数（growthraceconstant），即每小时分裂次数（R）的不同，可将生长曲线分为:延滞期、对数期、稳定期、衰亡期。,1.延滞期（lagphase）,其它名称：停滞期、调整期、适应期现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。特点：分裂迟缓，代谢活跃。生长速率常数=0；细胞形态变大或增长；细胞内RNA特别是rRNA含量增高；合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶。原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物。,通过遗传学方法改变种的遗传特性-繁殖速度快的菌种；利用对数生长期的细胞作为“种子”；尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；适当扩大接种量（群体优势-适应性增强）,缩短延滞期措施：,2.对数期（logarithmicphase）,其他名称：指数期现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。特点：生长速率常数最大，即代时最短*；细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致；代谢最旺盛，营养消耗快。代时（generationtime，G）：单个细胞完成一次分裂所需时间，亦即增加一代所需时间。,影响代时的因素：菌种；营养成分；营养物浓度*；培养温度。公式：G=t1t0/nx2=x12nn=(lgx2-lgx1)/lg2导出G=(t1t0)/3.3(lgx2-lgx1),例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（B），经4h（t）后增加到49，000，000（b），这样，n(lg4.9107lg1.2104）0.30112,借助于n和t，还可以计算出不同培养条件下的代时G，Gt/n在本例中，G460/1220min该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖了12代。,不同种细菌的代时,菌名培养基培养温度代时E.coli（大肠杆菌）肉汤3717minE.coli牛奶3712.5Enterobacteraerogenes（产气肠细菌）肉汤或牛奶371618E.aerogenes组合372944B.Cereus（蜡状芽孢杆菌）肉汤3018B.thermophilus（嗜热芽孢杆菌）肉汤5518.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳杆菌）牛奶376687Streptococcuslactis（乳酸链球菌）牛奶3726S.lactis乳糖肉汤3748Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）肉汤3723.5Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌）葡萄糖2534446Mycobacteriumtuberculosis（结核分枝杆菌）组合3779293Nitrobacteragilis（活跃硝化杆菌）组合271200,不同温度下的代时,温度对微生物的代时有明显影响：E.Coli在不同温度下的代时温度（）代时（分）温度（）代时（分）10860352215120371720904017.525404520302947.577,营养物浓度与对数期生长速率和产量,作用方式：影响微生物的生长速率和总生长量,凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养，称为生长限制因子（growth-limitedfactor),应用意义：由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度；是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料；,3.稳定期（stationaryphase）,又称：恒定期或最高生长期特点：生长速率常数R为零新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。此时期的微生物开始合成次生代谢产物。,产生原因：营养物几乎耗尽；营养物的比例失调，如碳氮比不合适；有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）；物化条件（pH、氧化还原势等）不合适；,应用意义：发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：补充营养物质（补料）、调pH、调整温度；稳定期细胞数目及与菌体生长相平行产物的积累达到最高，是最佳的收获时期。,4.衰亡期（declinephase）,特点：生长速率常数R为负值细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降；细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放；因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等。产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡,丝状微生物的群体生长,丝状微生物的纯培养采用孢子或菌丝片断接种，在液体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌培养，以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。,可分为三个阶段：生长停滞期快速生长期衰退期,分批培养（batchculture）：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。连续培养（continuousculture）：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。,二、连续培养,连续培养理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。,按控制方式分按培养器的级数分按细胞状态分按用途分,内控制（控制菌体密度）：恒浊器外控制（控制培养液流速、以控制生长速率）：恒化器,单级连续培养器多级连续培养器,一般连续培养器固定化细胞连续培养器,实验室科研用：连续培养器发酵生产用：连续发酵罐,连续培养器,A.恒化连续培养,概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等），使其始终成为生长限制因子，从而使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一，产量低于最高菌体产量。应用范围：实验室科学研究,概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。,B.恒浊培养连续培养,恒浊器与恒化器的比较,连续发酵与单批发酵相比,优点：缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动控制；降低动力消耗及体力劳动强度；产品质量较稳定；,缺点：杂菌污染和菌种退化,三、同步培养,1.概念,同步培养(synchronousculture)：是一种能使群体中所有个体细胞转变成能同时进行生长和分裂的培养方法。,同步生长(synchronousgrowth)：通过同步培养的手段使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态,2.同步培养方法,机械方法,环境条件诱导法,离心方法,过滤分离法,硝酸纤维素滤膜法,温度,培养基成份控制,光照和黑暗交替培养,硝酸纤维素滤膜法,离心法,第四节影响微生物生长的主要因素,一、温度对微生物生长的影响,影响酶活性影响细胞膜的流动性影响物质的溶解度。,从微生物整体来看:生长的温度范围一般在-10100但对于特定的某一种微生物：只能在一定温度范围内生长，在这个范围内，每种微生物都有自己的生长温度三基点，即最低、最适、最高生长温度,根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为三个类型：,低温型微生物中温型微生物高温型微生物,粘质赛氏杆菌的生长最适温度为37，而合成灵杆菌素的最适温度为2025；黑曲霉生长最适温度为37，而产糖化酶的最适温度则是3234；以青霉素的生产为例：培养165小时采用分段控制温度的方法，其青霉素产量比始终在30培养提高了14.7%。302520250h5h40h125h165h,微生物不同生理活动要求不同温度，所以最适生长温度发酵速度快、积累代谢产物多。,微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群:专性好氧菌好氧菌微好氧菌兼性厌氧菌耐氧厌氧菌厌氧菌(专性)厌氧菌,二、氧气对微生物生长的影响,专性好氧菌（strictaerobe）,必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化酶（SOD，superoxidedismutase）和过氧化氢酶。,在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸产能；细胞含有SOD和过氧化氢酶。,微好氧菌（microaerophilicbacteria）,只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能，,兼性好氧菌（facultativeaerobe）,耐氧菌（aerotolerantanaerobe）,不具有呼吸链，依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。,厌氧菌（anaerobe）,分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。,三、pH,微生物的生长pH值范围极广，从pH10都有微生物能生长。绝大多数种类都生活在pH5.09.0之间。各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。,同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，对pH值的要求也不同。在发酵工业中，控制pH值尤其重要，举例：Aspergillusniger在pH22.5范围时有利于合成柠檬酸，当在pH2.56.5范围内时以菌体生长为主，而在pH7.0时，则以合成草酸为主。丙酮丁醇梭菌在pH5.57.0范围时，以菌体生长为主，而在pH4.35.3范围内才进行丙酮丁醇发酵。,生长的最适pH值与发酵的最适pH值,第五节有害微生物的控制,一、基本概念,灭菌（sterilization）采用强烈的理化因素使物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。如高温。消毒（disinfection）采用较温和的理化因素，杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的病原菌，而对被处理物体基本无害的措施。如75%酒精。,防腐（antisepsis）利用理化因素抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止物品发生霉腐的措施。包括低温、缺氧、干燥、高渗、高酸度、防腐剂。化疗（chemotheraphy）即化学治疗。利用具有高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，以达到治疗该传染病的一种措施。包括抗代谢药物、抗生素、生物药物素。,1、高温灭菌（）法是最常用的物理方法。高温可引起蛋白质、核酸等活性大分子氧化或变性失活而导致微生物死亡。,二、常用的灭菌、消毒、抑菌及除菌的物理方法,（一）温度,干热灭菌法（dryheatsterilization）灼烧法（incineration）：是将灭菌物体在火焰中燃烧，因其破坏力较强，故仅限于接种环、接种针、镊子的灭菌或带病原菌的材料、动物尸体的烧毁等。干燥热空气灭菌法(hot-airoven)：将物品放入烘箱内，然后升温至150170，维持12小时。适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌。特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死，所以温度高、时间长。,湿热法(moistheatsterilization)：特点：温度低、时间短、灭菌效果高原因：饱和水蒸汽穿透力强；蒸汽冷凝会放出潜热；湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定性，主要破坏氢键结构。,高压蒸汽灭菌法方法：121（1kg/cm2或15磅/英寸2）维持15-30min。112（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）20-30min。115（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）20-30min。应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度。适用：耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水的物品。,高压蒸汽灭菌锅,注意事项：排净冷空气；灭菌终了，缓慢降压；灭菌结束，趁热取出物品。,煮沸消毒法将水加热至100，煮沸15min30min，可杀死所有营养细胞和部分芽孢，达到消毒物品目的。巴斯德消毒法（Pasteurization）：低温长时法(LTH)；62.930min处理牛奶高温瞬时法（HTS):71.615s处理牛奶超高温巴斯德灭菌法(UHS):让液体食品停留在140左右3-4s，急剧冷却至75，经匀质化后冷却至20。,间歇灭菌法：将待灭菌物品在80-100蒸煮15-60min，冷却后搁置室温（28-37）下过夜，并重复以上过程三遍以上。适用于不耐高温的物品灭菌，如不适于高压灭菌的特殊培养基、药品的灭菌。缺点是麻烦、费时。,高温对培养基的影响及其防止措施,高温对培养基的不利影响：会产生混浊或形成不溶性沉淀营养成分被破坏（PO4-3存在，葡萄糖生成酮糖，菌不利用）；色泽加深（褐变如产生氨基糖等）；改变培养基的pH值（通常下降0.2）；形成有害物质，抑制微生物生长；消除有害影响的措施采用特殊的加热灭菌法过滤除菌法加入螯合剂,低温-低温是通过降低酶反应速度使微生物生长受到抑制。冷藏法：4，微生物斜面菌种放置冷藏箱中可保存数周至数月而不衰竭死亡；食品保鲜冷冻法：食品工业中采用-10左右的冷冻温度较长时间地保藏食品；冷冻法也可用作菌种保藏，但所需温度更低，如-80低温冰箱、或-78干冰、或液氮中冷冻保存。,2.低温抑菌,(二）辐射作用(radiationSterilization),辐射灭菌是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效力法。,微波:通过热产生杀死微生物的作用；紫外线(UV):使DNA分子中相邻的嘧啶形成嘧啶二聚体，抑制DNA复制与转录等功能，杀死微生物；X射线和y射线:使其他物质氧化或产生自由基(OH、H)破坏和改变生物大分子的结构，以抑制或杀死微生物。,（三）过滤除菌,应用：含酶、血清、维生素和氨基酸等热敏物质除菌,三、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂,（一）消毒剂可以抑制或杀灭微生物，但对人体也可能产生有害作用的化学试剂.主要用于抑制或杀灭物体表面、器械、排泄物和环境中的微生物。,石炭酸系数：指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度和达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为10分钟，而供试菌定为Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）。例P179,常用的消毒防腐剂及其应用,常用的消毒防腐剂及其应用,概念：指那些能够特异性地作用于某些微生物并具有选择毒性的化学药剂。种类：.抗代谢药物.抗