基因工程的下游技术重组蛋白的表达、纯化和分析.ppt

基因工程的下游技术重组蛋白的表达、纯化和分析,重组蛋白的表达表达体系：表达载体原核受体细胞真核,选择表达载体常用的关键元件：启动子和调节序列（表达强弱、细胞或组织特异性、表达调节等，如本实验的乳糖操纵子。）融合基因（纯化、标签，或增强蛋白可溶性等。如多聚His标签6His，便于镍柱亲和层析纯化。GST融合蛋白用GST柱亲和层析）分泌信号筛选标记其它,6His,重组蛋白的纯化亲和层析离子交换层析凝胶过滤层析,本单元实验流程：细菌（pEF-GFPuv）,亲和层析,IPTG诱导,细菌总蛋白,重组蛋白融合蛋白,乳糖操纵子的特性,SDS-PAGE,初步分析,实验十重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达,实验目的实验原理材料与试剂实验仪器操作步骤注意事项实验安排思考与讨论,实验目的了解和掌握IPTG诱导表达的原理。了解降解物阻遏的现象及其机理。,实验原理操纵子是基因表达的协调单位。通常由2个以上功能相关的结构基因以及一些调节序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。乳糖操纵子由三个结构基因Z、Y、A和操纵序列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成。,乳糖操纵子的诱导表达当没有乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使结构基因不能转录，也就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态。,乳糖操纵子的诱导表达（续）当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上，RNA聚合酶可以从启动子向3端移动，于是，结构基因可以转录出mRNA，然后翻译出蛋白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖操纵子被诱导。乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。IPTG是异乳糖的结构类似物。由于IPTG不会被分解，它的诱导作用是持久的。,乳糖操纵子的诱导表达（续）本实验所使用的表达载体上含有乳糖操纵子的调节序列，目的基因为绿色荧光蛋白基因。在IPTG的诱导下，目的基因表达可增强105倍。然而，诱导表达常常受到温度和诱导物的影响。,乳糖操纵子的降解物阻遏当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长时，通常优先利用葡萄糖，而不利用乳糖。只有当葡萄糖耗尽后，细菌才能充分利用乳糖，这种现象称葡萄糖效应，其实质是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又称降解物阻遏（catabolicrepression）。,乳糖操纵子的降解物阻遏（续）降解物阻遏的机理：代谢物基因激活蛋白（CatabolitegeneActivationProtein，CAP），又称cAMP受体蛋白（cAMPReceptorProtein，CRP）属于激活蛋白的一种，对乳糖操纵子进行正调节。CAP分子内分别有DNA结合区和cAMP结合区。当CAP与cAMP结合后，就可结合到CAP结合位点上，促进转录。葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低cAMP的浓度，抑制转录。,阻遏蛋白负调节与CAP正调节的协调当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用；而没有CAP存在时，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。只有在CAP存在且没有阻遏蛋白与操纵序列结合时，或者说只有高乳糖低葡萄糖时，操纵子发挥最大转录活性。这种协调与细菌对碳源的优先利用相一致。,Thestructureoflacoperon,调节序列,结构基因,Repressorandnegativeregulation,异乳糖,异丙基硫代半乳糖苷,异乳糖,CAPandpositiveregulation,低乳糖时,高乳糖时,在协调调节下，lacoperon的强诱导作用发生在高乳糖、低葡萄糖的状态。,材料与试剂材料含pUC18质粒工程菌及含pGFPuv质粒工程菌。试剂LB液体培养基：蛋白胨（tryptone）10g、酵母粉（yeastextract）5g、NaCl10g，加800mL双蒸水溶解，用10MNaOH调pH至7.2-7.5，定容至1000mL。分装，高压灭菌，4保存。,氨苄青霉素溶液：无菌双蒸水配成100mg/mL，分装，-20保存，使用终浓度为50g/mL或100g/mL。IPTG溶液：将238.3mgIPTG溶解于10mL双蒸水，0.22m细菌滤器过滤除菌，分装，-20保存备用，贮存浓度为100mM。20%葡萄糖溶液：20g葡萄糖溶解于适量双蒸水，定容至100mL，121，15min灭菌，4保存。,实验仪器超净工作台、恒温摇床、离心机等。,操作步骤挑取含pUC18质粒工程菌及含pGFPuv质粒工程菌单菌落，分别接种于含氨苄青霉（终浓度为100g/mL，以下同)的5mL的LB培养基中，于37、250rpm过夜培养12h-14h至对数生长期。取3支已灭菌的大试管，分别加入5mL含有氨苄青霉素的LB培养液，编号为1#，2#，3#，另取一个250mL的灭菌三角瓶，编号为6#，加入50mL含氨苄青霉素的LB培养液。,1#：接50L空载工程菌（含pUC18）过夜培养物，25-28培养10h-12h；2#：接50L重组菌（含pGFPuv）过夜培养物，25-28培养10h-12h；3#：接50L重组菌（含pGFPuv）过夜培养物，37培养至O.D600约为0.5（约3h-4h)，然后加入20%葡萄糖50L至终浓度为0.2%，及100mMIPTG5L至终浓度为0.1mM，25-28培养8h-10h或过夜；6#：接500L重组菌（含pGFPuv）过夜培养物，37培养至O.D600约为0.5（约3h-4h)，然后只加入100mMIPTG50L至终浓度为0.1mM，25-28培养8h-10h或过夜。,4.收集菌体。分别将1#-3#全部培养物收集到三个7mL离心管中，编上相应编号，离心弃上清；三角瓶培养的50mL菌液混匀后取5mL于7mL离心管中（编号为4#），离心，上清收集到另一个指管，编号为5#，其余的培养液用50mL离心管于5000rpm，4，离心10min，弃上清，菌体用裂解缓冲液重悬后用超声波破碎细胞或保存于20备用（见实验十二）。5.于紫外灯下观察1#-5#管收集的菌体或上清液，观察哪支管有荧光，记录观察到的现象。注意：把1#和2#管置4保存。分别标Sample1和Sample2。,1,2,3,6,pUC18,pGFPuv,挑取单菌落，接种于5mLLBA培养基中。,37过夜培养。,按1:100接种,对照,IPTG+Glc,IPTG,1,2,3,6,1,2,3,4,5,25-28培养过夜,5000rpm离心，收菌体,取5mL离心,其余离心收菌体，提取蛋白,注意事项本实验的目的是比较该重组DNA在大肠杆菌中表达时受IPTG和葡萄糖存在的影响。在转管培养及收菌时要注意各管编号要相应对好，不能混乱。1#、2#管不加IPTG和葡萄糖。3#管除加IPTG外还加入葡萄糖（浓度要大于0.2%以上）。6#瓶仅加IPTG。,不同的重组DNA在不同的宿主菌中蛋白的表达量往往受到IPTG浓度和培养温度的影响。在科研中一般都采用不同温度或不同浓度的IPTG来诱导，以获得最大的蛋白表达量。本实验所表达的绿色荧光蛋白基因，其产物在大肠杆菌中有很强的荧光。离心后收集的菌体在紫外线的照射下可见黄绿色荧光，所以把1#、2#、3#、4#沉淀菌体放在紫外灯下观察其是否有荧光以及荧光的强弱，就可判断其是否有表达及其所表达的强度。,实验安排第一天：上午配试剂，灭菌；下午开始接种，约3h-4h后开始诱导。（步骤2、3）第二天：收菌、紫外观察结果和拍照；破碎细菌，分离上清，待过柱。,思考与讨论对紫外灯下观察到的结果作出解释。为什么诱导表达的大肠杆菌要在其OD600浓度约为0.5时加入IPTG？大肠杆菌的诱导表达常受哪些因素的影响？,实验十二金属鳌合亲和层析分离目的蛋白质,实验目的实验原理材料与试剂实验仪器操作步骤注意事项实验安排思考与讨论,一实验目的学习亲和层析的原理。掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作。,实验原理以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这种方法称为金属螯合亲和层析。蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。,过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质。在碱性pH时吸附更有效，但选择性降低。金属螯合亲和层析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。用IPTG诱导表达的蛋白质含有特定的组氨酸标签，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。,材料与试剂材料含pUC18质粒工程菌及含重组pGFPuv质粒工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白。试剂0.05mol/LEDTA-0.5mol/LNaCl溶液50mL2mol/LNaCl溶液50mL1mol/LNaOH溶液50mL0.2mol/LNiSO4溶液30mL,起始缓冲液：50mmol/LTris-HCl;500mmol/LNaCl;pH7.0500mLChelatingSepharoseFastFlow4-5mL大肠杆菌细胞裂解蛋白样品10-20mL洗涤液：50mmol/L咪唑；50mmol/LTris-HCl；0.5mol/LNaCl，pH7.0洗脱液：300mmol/L咪唑；50mmol/LTris-HCl；0.5mol/LNaCl，pH7.0,实验仪器1.5cmX50cm层析柱、自动分部收集器、紫外分光光度计、紫外检测仪及记录仪等。,操作步骤样品的制备:细胞的培养及荧光蛋白表达见实验十，细胞的破碎及蛋白的收集如下：收集在25培养的细胞培养液，5000r/min，离心10min，去上清液，菌体用起始缓冲液洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一（细胞培养液）体积（15mL）的起始缓冲液充分悬浮，冰浴下进行超声波处理，功率为400W，工作4秒，间隙4秒，为一次，99次为一周期。共处理六周期。然后8000r/min,离心30min，取上清液。放冰箱备用。,亲和层析柱的安装把层析柱固定在铁支架上，柱下端出口封闭。加入少量的无离子水，排去下端的空气泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝胶4mL到烧杯中，加入少量的无离子水制成糊状，沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状凝胶倒进柱内，打开下端的排水口，让亲和凝胶剂随水流自然沉下。亲和层析剂为4-5mL。,亲和凝胶的再生处理：用10倍柱体积的再生溶液（0.05mol/LEDTA、0.5mol/LNaCl）过柱，流速3mL/min。1drops/2s!用5倍柱体积的2mol/LNaCl溶液洗亲和层析柱除去多余的EDTA。流速3mL/min。用5倍柱体积的1mol/LNaOH溶液洗涤层析柱，流速2mL/min。用10倍柱体积的无离子水洗至pH8-9，流速3mL/min。用2倍柱体积的0.2mol/L的硫酸镍溶液过层析柱，使凝胶金属镍离子结合,流速2mL/min。过完后放置5分钟。用10倍柱体积的无离子水洗涤层析柱除去多余的镍离子。流速3mL/min。用5倍柱体积的起始缓冲溶液平衡层析柱，备用。,上样：先从15mL裂解上清液中取出50L准备用于电泳，作为亲和层析分离前上清液中的总蛋区带对照图谱（Sample3）。然后以每分钟1mL的流速上层析柱，分部收集流出液，每管3mL，（测得的OD280值曲线为穿流峰，取最高的一管样品液用作电泳，标Sample4）。再用10mL起始缓冲液过层析柱，操作同前。洗涤：用含50mmol/L咪唑的洗涤缓冲液25mL洗脱，分部收集洗脱液，每管5mL，取中间管样品电泳（Sample5）。,洗脱：用含300mmol/L咪唑的洗脱缓冲液10mL洗脱，用Ep管分部收集洗脱液。每管收0.5mL。（测得的OD280值曲线峰为目的蛋白峰GFP，标Sample6）。12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测亲和层析分离纯化的结果。Sample1-6，外加Marker（见实验十一）。,注意事项不管是装柱还是上样、洗脱，在整个操作过程中，水或溶液面都不能低于凝胶柱平面。否则，凝胶柱会产生气泡，就会影响层析效果。样品上柱和洗脱过程，其流速都要慢，分离效果才好。亲和层析剂可回收，经再生可循环使用。该亲和层析剂用20%乙醇浸泡于冰箱保存。亲和层析柱在再生处理、上样、洗脱过程中其颜色都有明显变化（白、蓝、绿），只要细心操作，样品是否被吸附上去或被洗脱下来？都能观察到从而作出判断。,实验安排先用母液配制其它未配制溶液，再生镍柱；然后，过柱纯化重组蛋白。,思考与讨论解释IPTG诱导表达的荧光蛋白经12SDS-PAGE电泳结果图谱。镍柱在再生处理、上样、洗脱过程中其颜色有何变化？为什么？要达到好的分离效果要注意哪些问题？,实验十一SDS-PAGE电泳分离蛋白质,实验目的实验原理材料与试剂实验仪器操作步骤注意事项实验安排思考与讨论,一.实验目的了解SDS-PAGE灵敏度高，分辩率强的原理。用此法分析不同条件下培养的菌其荧光蛋白表达情况。,实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide,简称ACR）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylenebisacrylsmide简称BIS）在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶，通过改变单体浓度与交联剂的比例可以得到不同孔径的凝胶。,聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，加速剂为N、N、N、N四甲基乙二胺（简称TEMED）。通常控制这两种溶液的用量使聚合在1h内完成。（2）光聚合：通常用核黄素为催化剂，通过控制光照时间和强度来控制聚合时间也可加速反应。本实验采用化学聚合。聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第二类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳。,通常聚丙烯酰胺凝胶（不连续）电泳有三种效应：电荷效应；（电泳物所带电荷的差异性）。凝胶的分子筛效应。（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）浓缩效应，（凝胶浓度的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、电位梯度的不连续性以及pH的不连续性所致）。因此，样品分离效果好，分辨率高。,SDS-PAGE，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）。SDS破坏蛋白质的二级和三级结构；强还原剂使半胱氨酸之间的二硫键断裂，因此，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量的SDS，降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。而由于SDS与蛋白质的结合是按大小成比例的，在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。,试剂30%的凝胶贮备液:Acr29g+Bis1g溶于100mL去离子水中。避光贮存棕色瓶中。3MTris-HCl(pH8.9):36.6gTris-base+48mL1MHCl+dH2O至100mL5Tris-甘氨酸电泳buffer（pH8.3):Tris-base15.1g+甘氨酸94g+5gSDS+H2O至1L（用时稀释5倍）。,10%SDS：10gSDS溶解于100mL去离子水中，贮存于室温中。0.5MTris-HCl(pH6.8):6.05gTris-base+48mL1MHCl+dH2O至100mLTEMED(四甲基乙二胺):浓度10%，20mL(共用)10%AP(过硫酸铵):10mL，1gAP溶解于10mL去离子水中，新鲜配制。,2x样品缓冲液：100mMTris-HCl(pH6.8)200mMDTT(二硫苏糖醇)4%SDS0.2%溴酚蓝20%甘油考马斯亮蓝染色液：0.25g考马斯亮蓝R250溶于45mL甲醇中，加10mL冰醋酸+H2O至100mL。（滤纸过滤除去不溶物）脱色液：75mL冰乙酸+50mL甲醇+875mLH2O（如只配500mL，各物质减半）,实验仪器电泳仪、垂直板电泳装置、微量进样器（50L）、染色/脱色摇床等。,操作步骤胶板模型的安装：在干净的带隔板的玻璃板的三条边上把橡胶条压上，然后将另一块凹形玻璃板压上，放入电泳槽中。（示范）12%分离胶的制备（每次配10mL）去离子水3.2mL30%凝胶液4.0mL3mol/LTris-HCl(pH8.9)2.6mL10%SDS0.1mL10%APS0.1mLTEMED0.005mL,用手轻摇约2分钟混匀(注意不要产生气泡）,小心将混合液注入准备好的玻璃板间隙中，为浓缩胶留足够的空间，轻轻在顶层加入几毫升去离子水复盖，以阻止空气中氧对凝合的抑制作用。刚加入水时可看出水与胶液之间有界面，后渐渐消失，不久又出现界面，这表明凝胶已聚合。再静置片刻使聚合完全。！注意：为避免凝胶过快聚合，配胶用的无离子水、30%的凝胶液及Tris-HCl缓冲液应事先于4或冰上放置,以下同。,浓缩胶的制备：先吸去已聚合好的分离胶上层的水，用水洗界面一次，再用滤纸吸干残留的水液。按下列配方制备5毫升浓缩胶溶液。混合后将其注入分离胶上端，插入梳子应小心避免气泡。去离子水3.2mL30%凝胶液0.83mL0.5MTris-HCl(pH6.8)0.75mL10%SDS0.050mL10%AP0.050mLTEMED0.005mL,在浓缩胶聚合的同时，将样品与5样品缓冲液（16L4L）混合，100加热3分钟以变性蛋白质。Sample1,2用600L起始缓冲液悬浮，取16L同上操作。浓缩胶聚合完全后，小心地拔出梳子，用无离子水冲洗梳孔，将凝胶模板放入电泳槽上固定好，上下槽均加入1X电泳缓冲液，检查有无漏液，除去两玻璃板间凝胶底部的气泡，上样前用上槽缓冲液冲洗梳子孔。按次序上样：用微量进样器往凝胶梳孔中加样品混合液，20L/孔，一孔加一个样品，同时安排已知分子量的标准物作对照。,电泳：开始时浓缩胶电压为80V，染料进入分离胶后，将电压增到120V，继续电泳至染料（溴酚蓝）到