DNA的复制修复及重组DNA技术医学生物化学上海交通大学医学院PPT课件

-,1,分子生物学的中心法则(centraldogma)DNARNA蛋白质,复制,转录,翻译,逆转录,RNA复制,-,2,第一节DNA复制的几个基本原则（特点）一、半保留复制（semiconservativereplication）,模板原则特点,亲代的DNA双链，每股链都可作为模板按碱基配对原则指导新链的合成合成的两个子代DNA分子碱基顺序与亲代分子完全一样一条链来自于亲代的DNA链，另一条链是新合成的链,-,3,亲代DNA,子代,子代,半保留复制,新合成的链,-,4,-,5,二、半不连续复制（semidiscontinuousreplication）1、体内仅存在53的DNA聚合酶2、前导链与随从链（岗崎片段）,-,6,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,前导链,随从链,岗崎片段,半不连续复制,-,7,前导链（leadingstrand）：DNA复制时，一股以35方向的母链作为模板，指导新合成的链以53方向连续合成的链称为前导链。（复制方向与解链方向一致）,-,8,随从链（laggingstrand):DNA复制时，一股以53方向的母链作为模板，指导新合成的链沿53合成，10002000个核苷酸不连续的小片段的链称为随从链。（复制方向与解链方向相反),-,9,岗崎片段（Okazaki）：DNA复制时，一股以53方向的母链作为模板，指导新合成的链沿53合成10002000个核苷酸不连续的小片段称之为岗崎片段。岗崎片段由DNA连接酶连成一条完整的新链。,-,10,半不连续复制：在DNA复制过程中，亲代DNA分子中以35方向的母链作为模板指导新的链以53方向连续合成，另一股以53为方向的母链则指导新合成的链以53方向合成10002000个核苷酸长度的许多不连续的片段（岗崎片段），这种复制方式称之为半不连续复制。,-,11,三、RNA引物,DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP在DNA模板上聚合需要具3-OH的引物,RNA聚合酶能催化两个游离的NTP在DNA模板上聚合提供3-OH引物最后要被DNA聚合酶除去，缺口由该酶补满，再由连接酶连接,减少突变，提高DNA复制的真实性,-,12,5,5,3,3,5,5,3,3,前导链,随从链,岗崎片段,RNA引物,3-OH,-,13,四、复制的真实性DNA的半保留复制遵守严格的碱基配对规律RNA引物DNA聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能复制出错是有即时的校读功能(35外切酶功能）DNA损伤的修复机制,-,14,第二节参与DNA复制的一些酶类和蛋白质,DNA链合成的条件dNTPMg+3-OH引物DNA模板酶和蛋白质因子,-,15,酶和蛋白质因子DNA聚合酶/DNA解链酶DNA结合蛋白(SSB）拓扑异构酶/引发体DNA连接酶,-,16,一、大肠埃希菌DNA聚合酶（原核生物）,3,5-磷酸二酯键,3,5,图12-4,-,17,DNA聚合酶多功能酶53外切酶35外切酶53聚合酶单链多肽大小二个片段切除RNA引物，填补空缺损伤后修复,DNA聚合酶与多功能酶53聚合酶35外切酶不对称二聚体单体1-前导链/单体2-随从链DNA复制的主要酶高续进性高聚合酶活性高产物真实性,-,18,3553外切酶聚合酶,N,C,53外切酶,小片段,大片段（klenow片段）,切除RNA引物损伤修复,校读功能,（常用的工具酶）,DNA聚合酶（DNAPolymerase）Kornberg酶DNA指导的DNA聚合酶（DNA-DirectedDNAPolymerase,DDDP）,聚合功能,-,19,DNA聚合酶全酶（DNAPolymeraseholoenzyme）,10种不同亚基组成2DNA聚合酶(4个)DNA聚合酶全酶,核心聚合酶二聚体形式连接两个核心聚合酶单个运载夹钳星环状,容纳DNA双链,-,20,-,21,二、真核细胞的DNA聚合酶,五种DNA聚合酶DNA聚合酶和PCNADNA聚合酶DNA聚合酶、,参与随从链的合成参与前导链的合成参与线粒体DNA的合成参与DNA的修复,-,22,三、解链、解旋酶类,DNA解链酶（helicase）DNA结合蛋白(SSB）,解开DNA双链每个bp消耗2个ATP与单链DNA结合,维持单链状态(“镇纸”)使其不受核酸酶水解避免单链DNA自身发夹螺旋形成使前端螺旋易解开,-,23,拓扑异构酶（topoisomeras）转轴酶拓扑异构酶旋转酶（gyrase）,切断DNA双螺旋中的一股，张力下降后封闭。切断DNA双链，使另一双链经过此缺口，再封闭。,-,24,四、引发体（primosome）,蛋白质DnaADnaB引物酶,结合到DNA双链复制起始部位(需ATP)解链酶的作用合成RNA引物,RNA引物的合成和复制的起始必需的,-,25,-,26,五、DNA连接酶,催化二段DNA链之间3,5磷酸二酯键的形成,3OH,5,5,3,OO-POO-,有缺口的DNA链,DNA连接酶,ATP,AMP+PPi,OOPOO-,5,3,缺口封闭,-,27,缺口填补:连接双股DNA分子中一链的缺口双链DNA分子中双链的缺口不能连接二分子单链DNA,-,28,应用:1.岗崎片段之间的连接.2.DNA损伤修复中的连接.3.一种重要的工具酶:限制性内切酶切割后形成的粘性末端或平头末端的连接.,-,29,第三节DNA复制过程(起始、延长、终止）,确定复制的起始点解开双链DNA,提供单链DNA模板形成复制叉DNA合成的起始和延长形成带有新合成的DNA片段的复制泡复制的终止,-,30,原核生物双向复制（型复制）特定起始点：oriC,真核生物多个复制单位（复制泡）（复制起始点+复制叉）多个起始点,一.复制的起始,-,31,大肠埃希菌复制起始点oriC的结构,-,32,原核生物双向复制（型复制）,-,33,真核生物复制泡（复制起始点+复制叉）,-,34,DNA双链复制起始点,DnaA,DnaB/DnaC,DNA双链解开成单链DNA,SSB,引物酶,RNA引物/3-OH,DNA聚合酶,dNTP,和3-OH形成35磷酸二酯键,解旋酶,解链酶,SSB,SSB,3,3,5,5,引发体,解链、解旋酶,拓扑异构酶,-,35,二.复制的延长1.在DNA聚合酶的作用下，2.前导链合成1000-2000个核苷酸后，3.随从链开始合成，岗崎片段的长度为1000-2000个（大肠杆菌）4.Pol为不对称二聚体，一个作用于前导链，另一个作用于随从链(loop)。,-,36,-,37,5,3,3,5,图12-13,-,38,图12-14,-,39,三、复制的终止,去除RNA引物补充空缺连接,DNA聚合酶的小片段53外切酶DNA聚合酶的大片段35外切酶53聚合酶DNA连接酶,-,40,3,5,5,3,-,41,四、端粒DNA的复制,1.端粒(telomere)真核生物染色体DNA是线性的每复制一次，子链的5有缺失。3端有特殊的序列,线性DNA末端的复制必须的-端粒端粒特征:3端是由数百个串联重复G丰富的6个核苷酸组成（AGGGTT）n人:5-AGGGTTAGGGTT-3端粒能稳定染色体,-,42,线形DNA复制末端问题,-,43,2.端粒酶（telomerase)-防止端粒缩短的酶组成蛋白质(DNA聚合酶)+RNA(合成端粒DNA的模板)唯一携带RNA模板的逆转录酶人端粒酶:模板(RNA-端粒酶):3-CAAUCCCAAUC-5合成(DNA):5-AGGGTT-3端粒酶和衰老、肿瘤有关,-,44,-,45,4.以延长的DNA单链为模板,3-OH为引物合成富含C的互补链,-,46,5.哺乳动物中端粒末端形成大的环状结构,环状DNA+蛋白质保护染色体3端的稳定,图12-17端粒的环状结构,-,47,第四节DNA的损伤与修复DNA修复的基础：一条链有损伤修复酶切除以未损伤的链为模板合成原来相同的序列,-,48,一.造成损伤的原因,自发因素物理因素化学因素,随机热碰撞紫外线损伤（共轭双键）电离辐射损伤（X线/线）亚硝酸盐CU5-溴尿嘧啶5-BUA氮芥类烷化剂羟胺C-A,G,G,羟胺,-,49,二.DNA损伤类型,点突变类型结果,转换-同型碱基颠换-异型碱基启动子/剪接信号影响整个基因功能编码序列蛋白质功能改变中性变化AA变化，功能不变静止突变碱基变，AA不变,-,50,缺失插入倒位,一个碱基/一段核苷酸/整个基因一段原来没有的碱基/核苷酸序列DNA链内部重组，一段方向颠倒,-,51,三.修复机制,光修复机制（低等生物）不需光复活酶需光复活酶,嘧啶单体嘧啶二聚体嘧啶单体嘧啶二聚体光复活酶（+）蓝光,280nm,239nm,-,52,切除修复1.UV特异核酸内切酶切除DNA聚合酶填补、修复DNA连接酶连接2.人体重要的修复方式3.缺乏UV特异核酸内切酶着色性干皮病,-,53,4个核苷酸,8个核苷酸,扩创,3-OH,-,54,碱基修复,1.DNA糖苷酶识别切除改变的碱基核酸内切酶切除磷酸二酯键DNA聚合酶填补DNA连接酶连接,-,55,2.识别的酶：（1）一类DNA糖苷酶，各具特异性e.g.尿嘧啶DNA糖苷酶识别DNA中的U（由C突变而来）（2）作用：识别-DNA中改变的碱基水解-改变的碱基与脱氧核糖间的糖苷键改变的碱基脱落,-,56,-,57,3.DNA碱基的组成为何是“T”？（1）DNA中的C容易突变成U（2）尿嘧啶DNA糖苷酶识别DNA中的U（由C突变而来）（3）若DNA中存在U，无法区别突变U和正常U（4）所以DNA中U甲基化/耗能生成T（5）DNA碱基中T的存在，增加遗传信息的稳定性（6）RNA中的U：数量多/半衰期短/经济,-,58,第五节重组DNA技术与基因工程,DNA重组（recombinationofDNA)自然界常见现象两个DNA分子间/一DNA分子的两个不同部位之间链断裂/片段交换重接改变基因的组合和序列交换可发生在同一细胞内（间）/不同生物,-,59,重组DNA技术实验室，人工的方法不同来源/不同种属的DNA片段拼接成重组DNA分子引入活细胞内大量复制/表达,-,60,基因工程/遗传工程/克隆克隆（clone):指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。,-,61,（三）重组DNA技术的基本步骤1.目的基因的获得2.目的基因与载体的连接3.重组DNA分子导入受体细胞4.筛选出含重组DNA基因分子的受体细胞克隆5.克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化,-,62,1.剪切,2.重组,3.转化,4.筛选,5.检测分离,-,63,一、剪切,剪切对象工具,目的基因载体限制性内切酶,-,64,目的基因的获得常用载体,基因组DNAcDNA人工合成DNA质粒噬菌体逆转录病毒,剪切对象,-,65,质粒（plasmid),存在细菌染色体外、散在分布环状DNA自我复制含有抗药基因：抗氨苄青霉素基因抗四环素基因（外源DNA插入此位点，可使其失活，在含其它抗菌素的培养基中生长。）,抗氨苄青霉素基因,抗四环素基因,-,67,常用的工具酶,1.限制性内切酶（restrictionendonuclease)(1)是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。(2)识别的DNA序列多为46个碱基(3)识别的序列都具有回文结构的特点,-,68,2.命名:e.g.HindIHindIIHindIII(流感嗜血杆菌中三个酶Haemophilusinfluenzaed)第一个字母（大写、斜体）该酶的微生物属名第二、三个字母（小写、斜体）代表微生物种名第四个字母（斜体）代表寄主菌的株或型用罗马数码I、II、III等区分同一株具有不同特异性的酶,-,69,3.分类及作用:I型、II型、III型（1）II型酶的识别识别序列一般为4-6个碱基对，具有回文结构。,-,70,（2）II型酶的切割功能平末端（bluntend)在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割。HpaIHpaI5GTTAAC35GTT+AAC33CAATTG53CAATTG5,-,71,5端粘性末端（cohesiveend)在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5末端切割。EcoRIEcoRI5GAATTC35G+pAATTC33CTTAAG53CTTAAp+G5,-,72,-,73,3端粘性末端在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3末端切割。PstIPstI5CTGCAG35CTGCA+pG33GACGTC53GpACGTC5,-,74,4.II型限制酶的用途（1）构建DNA重组体、克隆及亚克隆（2）DNA杂交与序列分析（3）改建质粒（4）构建基因组DNA物理图谱和文库等,-,75,二、连接成重组体：工具酶：DNA连接酶连接带匹配粘端的DNA分子。使平端的双链DNA分子互相连接或与合成接头相连接。,-,76,反应例解：（1）互补粘端DNA或切口间的连接5ACGOHpAATTCGT33TGCTTAApHOGCA5ATP、Mg2+T4连接酶5ACGAATTCGT33TGCTTAAGCA5,-,77,（2）平端连接5CGAOGpCGTA33GCTpOHGCAT5ATP、Mg2+T4连接酶5CGACGTA33GCTGCAT5,-,78,三、重组体DNA分子引入宿主细胞,原核细胞(大肠杆菌)-转化动物细胞-转染、转基因四、筛选抗药性标志LacZ基因