核酸印迹与分子杂交

分子生物学技术,高颖gaoying822,核酸印迹技术与分子杂交,NucleicAcidBlottingandMolecularHybridization,核酸分子杂交（nucleotidemolecularhybridization）以DNA的变性、复性为理论基础；指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程。,Southern印迹（Southernblot）,基本操作过程待测DNA样品制备、基因探针标记；待测DNA样品的电泳分离；电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的固相支持物；特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，放射自显影或显色检测目的DNA的存在。,Southernblot基本流程,Southernblot关键步骤待测DNA样品的酶切消化基因组DNA进行消化，才能在电泳过程中将不同长短的DNA片段分离开。基因探针的标记探针序列和探针信号的选择。要考虑特定基因的重复性、保守性和稳定性。可用同位素和非同位素标记。,Northern印迹（Northernblot）,是将RNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，定性分析mRNA的常用方法。注意事项：RNA易被酶降解。可用于分析基因转录水平的变化。,Westernblot（蛋白免疫印迹）技术是将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶中转印到化学合成膜的支撑物上，利用特异性抗体进行反应，定性分析蛋白质。用于分析基因表达(蛋白水平）的变化。,原位分子杂交技术,利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术。组织、细胞或染色体的固定；探针；与探针结合的标记物；可用于基因及其表达产物的定位分析。,聚合酶链式反应,PolymeraseChainReaction,聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；由K.Mullis于1983年建立；1999年获诺贝尔化学奖。可用于分析基因及其产物的水平变化；可进行实时、定量分析；,PCR体系,模板引物耐热DNA聚合酶dNTPs含Mg2+的缓冲液,PCR的过程,变性(Denaturing)95DNA模板变性成为单链，引物自身和引物间的局部双链消除退火(Annealing)引物与模板DNA杂交，Tm值减5延伸(Extension)DNA聚合酶在72催化DNA的合成,ing,PCR技术的工作原理,17,PCR技术,PCR分析已知基因；反转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）是将RNA的反转录和PCR联合应用的一种技术。RT-PCR是从组织或细胞中获得目的基因及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的有效方法。,RT-PCR与PCR区别模板为mRNA需逆转录酶产物为cDNA,19,反转录合成cDNA,实时、定量PCR技术,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程。通过标准曲线对样品中的DNA的起始浓度进行定量的方法。特点：对DNA/RNA模板定量，灵敏度强，特异性高。,21,实时、定量PCR技术,Q,R,3,3,5,5,上游引物,下游引物,荧光标记引物,R,Q,3,3,5,5,DNA序列测定,DNASequencing,DNA序列分析方法,双脱氧链终止法利用2，3-双脱氧核苷酸掺入中，终止化学反应化学裂解法利用化学试剂裂解修饰碱基终止聚合反应,戊糖,DNA的序列测定,26,双脱氧链终止法,dA,DNA自动测序,用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,DNA序列自动分析,ddG,红,ddT,ddA,绿,ddC,蓝,橙,毛细管电泳,荧光标记,DNA合成,测序结果展示,DNA自动测序结果举例,DNA序列分析可以揭示基因和基因组一级结构变化,通过DNA序列分析可以鉴定基因和基因组的变异通过DNA序列测定分析人工重组的基因通过DNA序列测定对定点突变进行确认,DNA芯片技术,DNAChipTechnologies,DNA芯片（DNAchip）也称DNA微阵列(DNAmicroarray)在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探针，与待测荧光标记样品进行杂交；通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息；包括cDNA芯片和寡核苷酸微阵列,基因芯片工作流程,DNA芯片技术,cDNA芯片探针是cDNA片段，可以同任何具有同源序列的样品形成杂交体，同时定量监测大量基因的表达。寡核苷酸芯片基因特异的寡核苷酸片段为探针，对低丰度基因表达水平变化的检测具有高度灵敏性。可进行高通量基因转录活性的分析,DNA芯片技术的特点快速、高效、敏感、平行化、自动化。通过芯片技术筛选得到的表达信息还要用Northernblot或定量RT-PCR进行验证DNA芯片技术的应用肿瘤基因表达谱的差异研究；基因多态性分析；微生物筛选鉴定；遗传病产前诊断等,蛋白质芯片和组织芯片,蛋白质芯片蛋白质检测芯片蛋白质功能芯片组织芯片是以形态学为基础进行高通量检测基因表达信息的芯片技术,蛋白质芯片技术优势在蛋白质结构、功能和相互作用，以及疾病发展过程中蛋白表达谱差异研究等方面。在临床医学研究中，利用蛋白