流式细胞术临床应用

.流式细胞术的临床应用一、在肿瘤学中的应用这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析，PI可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1 / GO期具有二倍体细胞的DNA含量(2 N)，而G2/ M期具有四倍体细胞的DNA含量(4 N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO期，S期和G2/ M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率，DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。 1、发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变，FCM可精确定量DNA含量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。2、在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用 FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。 FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。3、FCM在细胞凋亡和多药耐药基因的研究中的作用研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用Annexin V结合PI或7- AAD双染色法进行细胞凋亡分析。在凋亡的早期阶段，胞浆膜磷脂的不对称性丧失，导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异的Annexin- V探针所标记。PS转移到细胞膜外不是细胞凋亡特有的，也可发生在细胞坏死中。但在凋亡的早期细胞膜是完整的，而细胞坏死时细胞膜的完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，Annexin- V结合PI或7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin-V，坏死和凋亡晚期细胞可被Annexirr V和PI或7- AAD同时染色。多药耐药是肿瘤病人化疗失败的主要原因，FCM对多药耐药基因(MDR-1、P170等)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表达的测定，可为临床治疗效果分析提供有力依据。二、在临床细胞免疫中的作用FCM提供了一种简捷地监测细胞亚群的方法。即通过荧光抗原和抗体检测技术对淋巴细胞膜表面分化抗原(CD分子)、细胞分类和各亚群进行分析，并计算出淋巴细胞各亚群的百分比，从而对人体细胞免疫状态进行评估。在某些病毒性疾病的感染血液病、原发性和继发性免疫缺陷病、肿瘤的疗效观察和预后判断以及器官移植的监测上起着重要的指导作用。如正常人群淋巴细胞CD3+CD4+/CD3+CD8+比值大约为21，但在人体细胞免疫力低下时可出现比例倒置。用FCM还可以监测肾移植后病人的肾排斥反应，如果CD3+CD4+/CD3+CD8+比例倒置，病人预后良好，较少发生肾排异现象；反之排异危险性增加。同样此种测定技术也用于爱滋病的诊断和治疗中。白细胞表面分化抗原的检测：CD3+： T淋巴细胞；CD45RA：未受刺激（Naive）T淋巴细胞；CD45RO：记忆T淋巴细胞CD3-CD19+： B淋巴细胞CD3-CD16+56+： NK细胞【NK细胞表达众多表面分子，如CD56、 CD16、 CD57、CD161等，但这些表面标志都不是NK细胞所特有的，只具有相对特异性。通常将CD56+、CD16+、CD3-、TCR-、BCR-的淋巴样细胞认为是NK细胞。以CD56+CD16+，CD56+CD16-和CD56-CD16+为标志将NK细胞分为3个亚群，发现CD56是NK细胞分化的特异性标志，而CD16的表达量与NK细胞的杀伤活性密切相关。在上述研究基础上许多学者主张以CD56的表达密度不同，将NK细胞分为CD56bright和CD56dim两群. CD56brightNK细胞高表达CD56, 低表达CD16, KIR(killer cell immunoglobulin-like receptors, KIR)；表达高亲和力的IL-2 受体。而CD56dim NK细胞高表达CD16，低表达CD56，仅表达中亲和力的IL-2受体。 CD56bright NK细胞在IL-2的作用下表现出较强的增殖作用，而CD56dim NK细胞几乎不分泌细胞因子，且IL-2不能促其增殖。CD56dim NK细胞表现出较强的杀伤活性，而CD56bright NK细胞杀伤活性较低且表达一些末成熟标志，可以认为CD56bright NK细胞是未成熟的NK细胞，而CD56dim及NK细胞则相对较成熟，即NK细胞发育可能经历CD56bright NK细胞到CD56dim NK细胞这样一个过程。】CD64： 单核、巨噬细胞CD1a、CD83： 树突状细胞CD3+CD4+CD8-：T辅助/诱导淋巴细胞标记（Th/Ti）；CD3+CD4+CD29+：T辅助淋巴细胞诱导亚群标记，辅助B淋巴细胞产生抗体和诱导细胞介导的淋巴细胞溶解作用；CD3+CD4+CD45RA+：T抑制淋巴细胞诱导亚群，诱导Th的活化和辅助其功能。T辅助细胞还可分成Th1、Th2两个亚群，同时标记细胞内细胞因子IFN-和IL-4，可区分Th1细胞（CD4+/ IFN-+）和Th2细胞（CD4+/ IL-4+）。CD3+CD4-CD8+：T抑制/杀伤淋巴细胞标记（Ts/Tc）；CD3+CD8+CD28-：抑制性T淋巴细胞；CD3+CD8+CD28+：细胞毒T淋巴细胞；CD3/HLA-DR：同时计数外周血静止T淋巴细胞（CD3+HLA-DR-）、B淋巴细胞（CD3-HLA-DR-）及活化T淋巴细胞（CD3+HLA-DR+）；CD25：白细胞介素2低亲和力受体，其中CD3+CD25+为活化T淋巴细胞，CD3+CD25-为静止T淋巴细胞；CD34、CD38 、CD117、HLA-DR： 造血干、祖细胞CD59： PNH疾病监测；CD23： IgE低亲合力受体，变态反应病、自身免疫、白血病和肾病综合症等病人PBL中CD23表达显著增加，阳性率与疾病严重程度正相关； CD44： 肿瘤患者CD44粘附分子与恶性度相关；目前FCM用的各种单克隆抗体试剂已经发展到了百余种，可以对各种血细胞和组织细胞的表型进行测定分析。三、在血液病诊断和治疗中的应用FCM通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析，对各种血液病的诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用。1、白血病的诊断和治疗形态学分型是白血病分型的基础，而白血病免疫分型则是形态学分型的重要补充和进一步深化。形态学分型是基于细胞水平的观察，属于直观判断，其准确度与检测者的水平及主观因素有关。由于白血病细胞的异质性及分化程度不同，使细胞形态学表现不典型，细胞发育幼稚，再加上混合细胞性白血病等，大约有20%30%病例难以明确诊断和分型。而应用FCM白血病免疫表型分析能够客观地、快速地分析异常细胞系来源及其分化阶段，大大地提高了白血病分型的准确性。常用的检测和鉴别白血病各系列的特异性标志为：T淋巴细胞白血病： 胞浆抗原 CD3、抗T细胞受体(TCR)、抗TCR、CD2、CD5、 CD8、CD10和CD7B淋巴细胞白血病： cCD79a 、CD22、CD19 、CD10、和CD20 +髓系白血病： 抗髓性过氧化物酶(cMPO) 、CD117、CD13、CD33、CD14、CD15和CD64NK淋巴细胞白血病： CD16、CD56和CD57红白血病： 血型糖蛋白A( Gly A) 和CD36巨核细胞白血病： CD41、 CD42和CD61 ;其中，cCD79a最具特异性，cMPO是髓系特异标志，cCD3和cCD79a分别表达于早期T细胞和B细胞。另外，常用的白血病系列非特异标志为：CD34和主要组织相容性抗原DR(HLA-DR）。，利用FCM可以测定出血细胞表达各种抗原的水平，协助临床确诊。同其它肿瘤的治疗一样，测定DNA倍体和进行细胞周期分析对指导白血病化疗有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病细胞增殖状况不同，定期了解细胞增殖情况采取相应药物可以提高疗效。目前临床除化疗药物治疗外还采用造血干细胞移植技术治疗急性白血病和一些疑难性疾病。FCM通过对人白细胞抗原(HLA)配型的测定可以为异体干细胞移植病人选择出最合适的供体。造血干细胞移植技术主要包括干细胞的鉴别、活性测定、干细胞动员和采集、分离纯化、保存扩增、肿瘤细胞的净化、干细胞回输以及术后保持移植物抗宿主病的低发生率等一系列过程。FCM测定CD34、HLA-DR、CD33等细胞表面标志物，成为干细胞移植技术重要的监测手段。用FCM检测一系列指标观察病人的恢复状态，可以对预后做出早期的判断。2、其它种类血液病的诊断和治疗监测阵发性睡眠性血红蛋白尿症是一种造血干细胞克隆病，细胞CD55、CD59抗原表达减低是该病的一个特点。该抗原属于血细胞表面磷脂酰肌醇锚连蛋白家族，是重要的补体调节蛋白，它通过与补体C8、C9的结合以阻止补体膜攻击复合物的形成，从而抑制细胞被补体激活溶解。FCM采用荧光标记的单克隆抗体对血细胞CD59的表达做定量分析，可以协助临床做出诊断并判断疾病的严重程度。 3、网织红细胞的测定及临床应用网织红细胞计数是反映骨髓造血功能的重要指标，FCM通过某些荧光染料(吖啶橙、噻唑橙等)与红细胞中RNA结合，定量测定网织红细胞中RNA，得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比。此外FCM还可以测量出网织红细胞的成熟度，对红细胞增殖能力的判断很有意义。为干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤病人放化疗对骨髓的抑制状况等提供了依据。 4、在血栓与出血性疾病中的应用(1)血小板功能的测定：正常情况下血小板以分散状态在血管内运行，但当血管损伤、血流改变或受到化学物质刺激时血小板被活化而发生一系列改变。由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断，血小板活化时其质膜糖蛋白较其静止期发生显著改变，FCM可以通过单抗免疫荧光标记(血小板膜糖蛋白b/a,CD62，CD63等)监测血小板功能及活化情况，有利于血栓栓塞性疾病的诊断和治疗。外血小板活化时其细胞内的钙离子浓度发生很大变化，借助于钙离子敏感荧光探针的帮助，用FCM测定钙离子浓度，可以作为活化血小板监测的非免疫性指标。(2)血小板相关抗体的测定：免疫性血小板减少性紫癜病人血浆中可产生血小板自身抗体，结合在血小板表面，称为血小板相关抗体，其分子可以是IgG、IgA或IgM，用羊抗人IgG、IgA、IgM荧光抗体标记被测血小板，FCM可以测定血小板相关抗体含量。直接法检测血小板表面的相关抗体，间接法可测定血清中的相关抗体。该方法用于该病的诊断及治疗监测，具有检测速度快、灵敏度高的优点。四、其他临床应用FCM在自身抗体(HLA- B27)检测中的应用HLA抗原是人类主要组织相容性复合体的表达产物，在免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别和诱导免疫应答、调节免疫应答的功能。根据HLA抗原结构、功能与组织分布的不同，可分为三类;I 、 II 、类分子。HLA-B27基因属于类MHC基因，在淋巴细胞的表面有丰富的含量。早在二十多年前，有人发现HLA - B27抗原的表达与强直性脊柱炎有高度相关性。超过90%的强直性脊椎炎患者其HLLA -B27抗原表达阳性，普通人群中仅5%10%为阳性，而强直性脊椎炎由于其症状与许多疾病相似而难以确诊，因此，HLA- B27的检测在病情的诊断中有着重要意义。用流式细胞术检测HLA- B27的表达，无须分离淋巴细胞，操作简便、快速、自动化程度高、灵敏度可达100，特异性达97. 4 %。FCM在人类同种异体器官移植期中的应用HLA是人类主要相容性复合物(MHC)与器官移植排斥密切相关。HLA可分为三类抗原，即I类、II类与III类，在这些抗原中，已肯定I类和II类抗原与移植有关。器官移植和骨髓移植成功的一个极其重要的因素是受、供体的组织配型，即移植前供受体的HLA分型对选择相合的供、受体十分重要。又由于移植后，移植物排斥移植物抗宿主病和原发病的复发等直接影响着患者和移植物的存活期。流式细胞术为移植前后