膜片钳技术数据处理与分析.ppt课件VIP

.,Clampfit10膜片钳实验数据的处理与分析,2014年4月23-25日杭州浙江大学,膜片钳技术高级培训班,刘振伟,.,2,一、膜片钳实验数据的处理二、全细胞记录数据的分析三、单通道记录数据的分析四、突触放电活动数据的分析,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,内容,.,3,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,一、基线的调零二、坏点的去除三、滤波四、数据文件内部/之间的数学运算,.,4,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,一、基线的调零,基线的确认全细胞记录基线易确认，单通道记录基线不易确认。单通道开放时间较长所记录的时间较短同时开放的通道数目较多且长时间持续开放确定通道电流的方向：电流方向向上，最负向是基线位置，反之亦然。如何确定：膜片两侧液体、钳制电位,.,5,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,.,6,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,基线不在零点的原因封接电阻的改变：漏电流失调电位的存在：偏移、漂移噪声的干扰：交流干扰高通滤波的影响：对记录线的起始部位产生影响,.,7,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,基线调零方法打开Analyze/Adjust/Baseline（1）Subtractmeanof（去除均值法）：适用于去除直流偏移。（2）Subtractslopeof（去除斜率法）：适合于去除持续线性漂移。（3）Subtractfixedvalue（去除固定值法）：适用于去除直流偏移。数值有正负之分。（4）Adjustmanually（手工调零法）：适合于单通道电流的基线或基线漂移无规律。,.,8,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,EpochA段,（1）Subtractmeanof（去除均值法）（2）Subtractslopeof（去除斜率法）,.,9,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,（3）Subtractfixedvalue（去除固定值法）（4）Adjustmanually（手工调零法）,.,10,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,基线调零的注意事项（1）有些只相对值（如电流幅度的变化值），不需要将基线调零。但多数情况需要基线调零，建议都要进行基线调零。（2）对于基线变动复杂的数据，基线调零可能会用到上述的几种方法。（3）对于某些基线变动，Clampfit中的基线调零方法可能也无法准确调零。建议最好在采集数据时就设法调整好基线。,.,11,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示基线调零方法,.,12,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,二、坏点的去除,坏点产生的原因刺激伪迹：给标本施加刺激时产生。电容瞬变电流：电容的充放电反应。瞬时脉冲干扰（Glitch）：打开电源开关（日光灯、仪器设备开启时）手机来电：一过性高频。人手靠近记录探头：高幅、高频。,膜片钳实验数据的处理,.,13,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,坏点的赋值（1）Datavalueatcursor1：Cursor1的数值。（2）Meanbetweencursor1.2：Cursor1-2之间均值。（3）Meanbetweencursor3.4：Cursor3-4之间均值。（4）Straight-linefitbetweencursor1.2：Cursor1-2之间的直线拟合值。（5）Fixedvalue(pA/mV)：输入一个固定的数值。,膜片钳实验数据的处理,.,14,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示去除坏点,.,15,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,注意事项（1）坏点太多时，应在记录前予以去除。（2）坏点持续时间短，如果出现持续时间较长的坏点，则数据要废弃。,膜片钳实验数据的处理,.,16,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,三、滤波,信号采集前的滤波全细胞通道电流记录：1-2kHz全细胞突触活动记录：10kHz单通道电流记录：10kHz动作电位记录：10kHz,膜片钳实验数据的处理,.,17,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,信号采集后的滤波,膜片钳实验数据的处理,.,18,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Lowpass,Highpass,Bandpass,Notch,ElectricalInterference,Clampfit滤波类型,膜片钳实验数据的处理,.,19,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Lowpass最为常用。Clampfit根据采样定理与Nyquist定理自动算出f-3dB范围并显示在该框底部。7种类型：（1）8-poleBessel：数据失真小，普遍用于时域数据。（2）Boxcar：数码滤波器，用于时域数据。当前数据点及其前后一些数据点（取决于Smoothingpoints，取3-99中的奇数）的平均值赋予当前数据点，完成滤波。Smoothingpoints值越大，数据幅度削减越大。（3）Gaussian：数码滤波器，同Boxcar，但当前数据点在平均值中所占的比例较大。（4）RC(8-coincident-pole)：用于时域数据。（5）RC(single-pole)：用于时域数据。（6）8-poleButterworth：用于频域数据。（7）8-poleChebyshev：用于频域数据。,膜片钳实验数据的处理,.,20,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示Lowpass滤波,.,21,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Highpass又称交流耦合（ACCoupling），可削弱低频信号而通过高频信号。Clampfit提供两种：8-poleBessel，单极RC采用-f-3dB，Clampfit自动计算出f-3dB范围并显示在该框底部。最常见的是在神经元上进行细胞内记录时使用高通滤波器，它可降低膜电位的低频振荡对突触电流的干扰。,膜片钳实验数据的处理,.,22,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示Highpass滤波,.,23,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Bandpass相当于低通滤波与高通滤波的交叉，需要同时设定高通滤波与低通滤波。高通滤波的f-3dB不能高于低通滤波的f-3dB。带通滤波用于欲记录的信号频率较为单一和固定时，对其它频率的噪声进行滤波。,膜片钳实验数据的处理,.,24,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Notch带阻滤波：削弱某一特定频率（如50Hz交流）信号。中心频率（Centerfrequency）：10-3,000Hz。频率宽度（3dBwidth）：频率宽度。-3dBwidth越窄，滤波需要的数据点越多，滤波效果越好。,膜片钳实验数据的处理,.,25,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示Notch滤波,.,26,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,ElectricalInterference（EI）电干扰滤波器（Electricalinterferencefilter,EI）为数码滤波器。可同时去除50Hz及其谐波（100Hz、150Hz等）的复杂交流噪声。Harmonicsfrom1to：用于设定欲去除的交流谐波的最高数目，最大数目为20（对应于1kHz），一般去除第1-3个就够了。Cyclestoaverage：数目越大，-3dB频率宽度越窄，滤波效果越好，但需时越长。Referencefrequency：选50Hz。,膜片钳实验数据的处理,.,27,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,EI所需最少数据点的计算举例滤波器所需最少数据点（采样频率/50Hz）Cyclestoaverage若采样频率10kHz，则一个50Hz正弦波周期的采样点数10kHz/50200点若设定Cyclestoaverage10，则需要的最少采样点数2,000点采样数据点不够的话，将不能清除谐波干扰。,膜片钳实验数据的处理,.,28,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,四、数据文件内部/之间的数学运算,Analyze/AverageTraces平均文件内任意几条相同的Trace，获得平均后的一条Trace。要求：Clampex软件的Fixed-lengthevents、Episodicstimulation和High-speedoscilloscope模式。重复记录的信号，时程必须固定不变。,膜片钳实验数据的处理,.,29,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,降低信号噪声信号频率谱与噪声频率谱一致或有重叠时，滤波不行。平均Trace的原理：设有N条Trace，则（见表）：先累加所有N条Trace，此时信号幅度增大为原来的N倍，而噪声却只增大为原来的N倍。然后再除以Trace条数N，信号幅度不发生大的变化，而噪声幅度却降低为原来的1/N。,膜片钳实验数据的处理,.,30,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示AverageTraces功能,.,31,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Analyze/SegmentedAverage可对几个Trace中的某一相同时段（如EpochA）或Cursor1-2之间的时间段进行平均，平均后的文件通常用于Analyze/SubtractControl功能中的ControlFile。,膜片钳实验数据的处理,.,32,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Analyze/Arithmetic对文件内的任何Trace进行加减乘除等运算，使原来的Trace得到新值。如t3=t1+t2，t3=2t1+3t2Results窗口中的该功能可对不同Column的数据进行运算，得到新的Column的数值。,膜片钳实验数据的处理,.,33,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Analyze/AverageFiles对几个文件进行平均。例如在进行相同的实验时，需要将几个采样文件相应的每一个Trace进行平均。平均后的文件会自动生成，文件名为Average000-999.abf。仅适用于EpisodicStimulation、High-speedoscilloscope模式的数据；Protocol设置必须一致。同样具有降低噪声的作用。,膜片钳实验数据的处理,.,34,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示AverageFiles功能,.,35,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Analyze/SubtractControl两个文件中所有相应的Trace进行相减，可用于去除漏电流或分离某种通道电流。要求两个文件要采用相同的Protocol来采集（信号数目、Sweep数目与长短、信号单位、采样频率）。Testfile为“大”文件“被减数”，ControlFile为“小”文件“减数”。Multiplycontroltracesby:将ControlFile中的Trace乘以该倍数，然后再从Testfile中减除。,膜片钳实验数据的处理,.,36,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示SubtractControl功能,.,37,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,注：如需要，可用Analyze/DataReduction或Interpolation功能使采样频率变为一致。若Testfile中的Signal或Sweep数少于Controlfile，后者多余的Signal或Sweep将不被使用。反之，若Testfile中的Signal或Sweep数大于Controlfile，后者最后一个Signal或Sweep将被反复使用。若Testfile中的Sweep长度小于Controlfile，后者Sweep中多余的点将不被使用。反之，若Testfile中的Sweep长度大于Controlfile，后者Sweep中最后一个点将被反复使用。,膜片钳实验数据的处理,以Testfile为准,.,38,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Analyze/ConcatenateFiles将在同一条件下获得的数据文件并成一个文件。同一条件是指相同的采集模式/采样频率/采样时间/信号个数连接后的文件会自动生成:Concatenate000-999.abf。,膜片钳实验数据的处理,.,39,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示ConcatenateFiles功能,.,40,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,全细胞记录数据的分析,一、离子通道的激活曲线二、离子通道的I-V曲线三、离子通道的衰减四、离子通道的失活曲线五、量效曲线,.,41,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜两侧电压差Vm改变，激活离子通道，用激活曲线描述。反映通道开启的速度及难易程度。,全细胞记录数据的分析,一、离子通道的激活曲线,.,42,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,给予细胞一系列脉冲电压来记录全细胞电流，作通道的激活曲线：X轴脉冲电压VmY轴全细胞通道电导g/gmaxBoltzmann方程拟合,全细胞记录数据的分析,.,43,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,g：全细胞通道激活电导gmax：全细胞通道最大激活电导Vm：不同的去极化（或超极化）脉冲电压V1/2：通道激活50%时的脉冲电压k：斜率因子（反映激活速度快慢，k越大，激活速度越慢）,全细胞记录数据的分析,Boltzmann方程,.,44,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,设：f(V)=gImax=gmax=1Vmid=V1/2V=VmVc=kC=0则即为前述的激活曲线方程：,全细胞记录数据的分析,Clampfit中的Boltzmann方程：Boltzmann,charge-voltage方程,.,45,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,先对数据进行处理（如基线调零、滤波、选择用于分析的Sweep数目等）。测量不同去极化脉冲电压下全细胞电流的峰值I（pA）。计算全细胞电导。gI/(VmVrev)对全细胞电导g进行标化：g/gmax，gmax=Imax/(Vm-Vrev)。作点图最后用激活曲线方程对散点图进行拟合,全细胞记录数据的分析,离子通道激活曲线制作步骤,.,46,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,全细胞记录数据的分析,Clampfit演示激活曲线的制作,.,47,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,全细胞记录数据的分析,几点说明（1）通过激活曲线的左移或右移以及半失活电压的变化等指标可以判断药物对通道开启过程的影响。（2）若要反映一类通道的激活特点或对不同组数据进行比较，需要有细胞例数上的要求，要求出平均g/gmax值与标准差，再作激活曲线。（3）通道反转电位可通过Nernst方程计算出来，也可直接测试出来，后者更准确。,.,48,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,离子通道电流-电压关系曲线（I-V曲线）：反映通道：激活过程、阈电位、反转电位、整流特性给予连续变化的步阶/斜坡脉冲电压Vm（范围大，最好跨越反转电位），测通道电流大小I，作I-V曲线：X轴VmY轴I药物可影响通道激活或衰减，使I-V曲线形状发生改变。,全细胞记录数据的分析,二、离子通道的I-V曲线,.,49,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,用Analyze/QuickGraph/I-V作I-V曲线适用于脉冲电压为歩阶（方波）形式的记录数据。,全细胞记录数据的分析,.,50,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,全细胞记录数据的分析,Clampfit演示用QuickGraph/I-V作I-V曲线,.,51,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,注意事项（1）通道未开放时，电流应该为零。因此要对基线进行细致的调零，可能要对每个Trace都进行基线调零。,全细胞记录数据的分析,.,52,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,（2）若要在一个细胞上测量多次，可选择Clampex中EditProtocol的Run功能，也可用Analyze/AverageFiles功能进行文件间的平均，得到某一个细胞的电流平均幅度值。,全细胞记录数据的分析,.,53,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,（3）测量同一种类多个细胞的I-V曲线，需要对电流幅度标化。原因：细胞大小不同，通道电流幅度不同。对于一个球形细胞，膜电容Cmd2/100(pF)（d为细胞直径(m)）例子：若细胞直径d=20m，其膜电容Cm=12pF。电流密度：I/Cm，I/Cm-V曲线Cm值的获得：（a）封接过程直接获得（b）OnlineStatistics窗口采集Cm，最后获得平均Cm值I/Imax-V曲线。,全细胞记录数据的分析,.,54,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,（4）如果从钳制电位开始去极化（或超极化），在I-V曲线上应不包含钳制电位这个数据点。,全细胞记录数据的分析,Vhold=-60mV,.,55,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,用Analyze/QuickGraph/Tracevs.Trace作I-V曲线适用于脉冲电压为斜坡（Ramp）形式的记录数据。,全细胞记录数据的分析,.,56,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,全细胞记录数据的分析,Clampfit演示用QuickGraph/Tracevs.Trace作I-V曲线,.,57,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,注意事项用（1）Cursor1、2的位置要放置准确，不要由于放置的误差导致出现错误。为了更好、更准确地放置Cursor，应该：（a）在采集时设计好Protocol。,全细胞记录数据的分析,不好,好,.,58,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,（b）应该以电流线（而不是Waveform电压线）为准设置Cursor。因为电流线滞后,全细胞记录数据的分析,1,2,2,1,.,59,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,（2）可通过选择对话框中的Append，将两条I-V曲线作在一个图中。,全细胞记录数据的分析,.,60,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,通道在激活因素（一般为去极化）持续存在条件下的失活衰减（Decay）衰减的指标：（1）时间常数；（2）10-90%衰减时间。,全细胞记录数据的分析,三、离子通道的衰减,Current,Waveform,.,61,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,衰减的时间常数通道电流的衰减过程可用单指数方程或者双指数方程拟合，获得衰减的时间常数。Clampfit软件中“Exponential,standurd”指数拟合方程：,全细胞记录数据的分析,：衰减的时间常数i=2时，为双指数方程，拟合后获得1和2两个时间常数值。,.,62,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,全细胞记录数据的分析,Clampfit演示衰减的拟合,.,63,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,10-90%衰减时间打开Analyze/Statistics窗口，除设置其他选项外，要在Measurement中勾上Risetime,From10To90%。OK后，在Window/Results窗口中可查看到结果。,全细胞记录数据的分析,.,64,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,给予细胞膜一个电压刺激，持续一段时间后，开放了的通道会逐渐失活，再给予电压刺激时，失活的通道将不再开放稳态失活（Steady-stateinactivation）。用失活曲线反映。,全细胞记录数据的分析,四、离子通道的失活曲线,.,65,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,失活曲线采用双脉冲设置的Protocol来获得数据条件脉冲将膜钳制在不同的电位水平，使相应部分通道处于完全失活状态。测试脉冲检测未失活通道的电流大小。X轴条件脉冲的电压数值Y轴测试脉冲的电流大小用Boltzmann方程拟合,全细胞记录数据的分析,.,66,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,I：不同条件脉冲电压下测试脉冲诱发的电流大小Imax：不同条件脉冲电压下测试脉冲诱发的最大电流Vm：不同条件脉冲电压V1/2：通道失活50%时的条件脉冲电压k：斜率因子（反映失活速度快慢，k越大，失活速度越慢）,全细胞记录数据的分析,Boltzmann方程,.,67,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,全细胞记录数据的分析,Clampfit中的Boltzmann方程：Boltzmann,charge-voltage方程,设：f(V)=IImax=1Vmid=V1/2V=VmVc=kC=1则即为前述的失活曲线方程：,.,68,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,失活曲线制作步骤（1）对数据进行分析前的处理：基线调零、滤波等。（2）测量不同条件脉冲下的测试脉冲诱发的全细胞电流峰值（I）。以测试脉冲的全细胞最大电流峰值Imax为1，对其它电流标化，计算出I/Imax。（3）以Vm为x轴，I/Imax为y轴，作点图。（4）最后用失活曲线方程对散点图进行拟合。打开Clampfit中的Fit窗口，选择Boltzmann,charge-voltage方程。,全细胞记录数据的分析,.,69,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,全细胞记录数据的分析,Clampfit演示失活曲线的制作,.,70,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,几点说明（1）通过失活曲线的左移或右移以及半失活电压的变化等指标可以判断药物对通道失活过程的影响。（2）同通道激活曲线一样，若要比较不同组之间的差异，作失活曲线也需要有细胞例数（n）上的要求，要求出平均I/Imax值与标准差，再作失活曲线。（3）在作失活曲线时，脉冲电压的设定要注意：条件脉冲时间要设定得足够长，以使通道在某一去极化水平的失活达到完全，这需要根据通道的失活特点来设定。Na+离子通道：衰减快，条件脉冲20ms宽L型Ca2+离子通道：衰减缓慢，条件脉冲的宽度十几秒条件脉冲与测试脉冲的间隔不能设定得过长，以防止失活的通道恢复，影响测试脉冲的测量。,全细胞记录数据的分析,条件脉冲,测试脉冲,.,71,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,概念量效曲线：X轴药物剂量/浓度大小Y轴药理效应强弱阈浓度半效浓度EC50最大效能效价强度,全细胞记录数据的分析,五、量效曲线,.,72,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Clampfit中的Hill方程：Hill(4parameterlogistic)方程（1）观察药物对某种受体/通道电流的诱发/增强作用时：Imax：药物作用后通道的最大电流幅度Imin：药物作用前的电流幅度C50：半效浓度EC50X：所施加的药物浓度h：Hill系数设通道电流的幅度为I，将Y轴设为I/Imax，拟合时，设Imax=1。若观察配体对受体通道诱发电流的情况，则拟合后，Imin接近0。,全细胞记录数据的分析,Clampfit中的Hill方程：Hill(4parameterlogistic)方程（1）观察药物对某种受体/通道电流的诱发/增强作用时：Imax：药物作用后通道的最大电流幅度Imin：药物作用前的电流幅度C50：半效浓度EC50X：所施加的药物浓度h：Hill系数设通道电流的幅度为I，将Y轴设为I/Imax，拟合时，设Imax=1。若观察配体对受体通道诱发电流的情况，则拟合后，Imin接近0。,.,73,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,（2）观察药物对某种受体/通道电流的阻断作用时：Imax：最大浓度药物作用后的电流幅度Imin：药物作用前的电流幅度C50：半抑制浓度IC50X：所施加的药物浓度h：Hill系数设通道电流的幅度为I，将Y轴设为I/Imin。拟合时，设Imin=1。若药物对通道电流完全阻断，拟合后，Imax接近0。,全细胞记录数据的分析,.,74,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,（3）观察配体诱发受体通道的电流时，因配体施加前通道不开放，可以采用Clampfit中的Hill,Langmuir方程对量效曲线进行拟合：设：i=1C=0C50：半效浓度EC50X：所施加的药物浓度h：Hill系数,全细胞记录数据的分析,.,75,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,例1.GABA诱发的GABA-A受体电流的量效曲线制作,全细胞记录数据的分析,GABA:0.5、1、5、10、50、100mol/L,.,76,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,全细胞记录数据的分析,Clampfit演示GABA电流的量效曲线,.,77,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,例2.荷包牡丹碱Bicuculline对GABA-A受体电流抑制作用的量效曲线制作,全细胞记录数据的分析,Bicuculline:0,0.1,1,10,100mol/LGABA:10mol/L,.,78,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,全细胞记录数据的分析,Clampfit演示Bicuculline的量效曲线,.,79,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,几点说明药物浓度的选择：（1）要含有阈浓度和最大效能浓度。（2）按一定倍比关系：如1、2、5、10、20、50、100等。（3）至少4个浓度。,全细胞记录数据的分析,.,80,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,药物施加原则：（1）按照从低到高浓度的顺序施加。在用浴槽灌流给药时要将前次药物冲洗掉，然后再给下一个浓度；在用培养皿时（难以灌流）每次施加的药量要少，防药物累加。（2）为获得稳定的量效曲线，药物从低到高的几个浓度最好在同一个细胞上施加。因此要求有合适的给药装置和高质稳定的全细胞记录。（3）正式实验前，需要先期做预实验来确定每个药物浓度的给药间隔时间，确保药物作用不受受体失敏的影响。,全细胞记录数据的分析,.,81,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,依据实验要求和药物特点选择给药方法：（1）配体或通道的激动剂的施加要求快速、微量的给药装置；（2）昂贵的药物一般不采用灌流给药，而采用压力喷射给药；（3）受体拮抗剂可与配体一起施加，也可预先加入拮抗剂；（4）用培养皿时，因灌流置换液体困难，要采用压力喷射给药方法；（5）直接用加样枪向培养皿或浴槽内滴加药物的方法，只用于简单的药物定性；（6）离子电泳的给药方法适合于能够离子化的药物。,全细胞记录数据的分析,.,82,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Clampfit的作图效果不理想，不适合正式发表文章。采用作图软件Origin制作量效曲线：选择Analysis/Non-linearCurveFit中的Logistic方程。,全细胞记录数据的分析,.,83,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,实验一般要求有细胞的个数（n），获得平均值和标准差。标准差可用作图软件Origin显示出来：在数据表窗口，选择Column/SetasYError。,全细胞记录数据的分析,.,84,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,不同药物量效曲线的比较要求：选择相同的浓度兼顾阈浓度与最大效能浓度。将两个量效曲线作在一起的方法：Clampfit在制作第2个量效曲线时选择Analyze/AppendtoGraph功能来制作。Origin采用在数据表直接输入数据的方法将几条量效曲线作在一个图中。以某药物最大诱发电流来标化其他药物例子：Nic诱发最大电流=100%ACh诱发电流与之比较,全细胞记录数据的分析,.,85,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,一、单通道电导的测算二、单通道开放概率的分析三、多通道开放概率的分析四、单通道I-V曲线五、单通道开放时间分布的直方图,.,86,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,单通道电导概念单通道电导（G）指通道完全开放（Fullopening）时，流经单通道的电流（i）与通道两侧电压差（钳制电位与通道反转电位的差值V）的比值，即：Gi/V电导的单位是西门子（Siemens,S），一般通道电导多为pS级，少数通道电导较大，可达nS级（1nS1pA/mV）。,一、单通道电导的测算,i(pA),V(mV),.,87,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,亚开放状态（Substate）不完全开放状态，电流幅度小。NMDA受体：两个开放状态（50pS主开放、40pS亚开放）人工纯化通道蛋白突变体：常有亚开放状态,.,88,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,闪烁现象（Flicking）。通道的高速开放与关闭导致通道开放或关闭持续时间太短的现象。包括：（1）通道高速短时开放；（2）通道在开放时高速短时关闭。,*,*,*,.,89,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,单通道电导的测算方法（1）简单粗略的方法：找到基线，观测单通道电流幅度峰值，并除以膜片两侧的电压差与反转电位的差值，就得到单通道电导G。例：膜两侧电压差（钳制电位）Vm=30mV反转电位Vrev=0mV测得电流幅度i=100pA则单通道电导G=100pA/(30-0)mV=3.33nS该方法相对粗糙，但可快速观察电导的大致变化。,.,90,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,（2）斜率电导(Slopeconductance)：通过单通道I-V曲线求得（见后）。,.,91,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,（3）直方图拟合法：拟合电流幅度分布，计算出单通道平均电导。高斯（Gaussian）方程对单通道电流幅度直方图进行拟合。Clampfit中的高斯方程：横轴x：电流幅度的bin值纵轴f(x)：检测的事件数目：单通道电流幅度的平均值：单通道电流幅度的标准差A、C：系数i1时，一极高斯方程G/V,.,92,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,Clampfit演示用Histogram功能和高斯拟合测算单通道电导,.,93,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,注意事项如果通道开放概率太低（只有很少的几个开放事件），则拟合会失真，此时需要延长采样记录时间以获得更多的开放事件。测算单通道电导时应选择单通道开放的峰值（Level1的峰值）。亚开放状态多时，会在单通道电流幅度峰值与基线峰值之间形成亚开放状态的峰值，据此可测算出亚开放电导。闪烁现象多会使单通道电流幅度曲线峰值的左右不对称，影响电导的测算。升高检测事件的阈值或限制事件持续时间，可去除闪烁现象。如果记录的数据中都是闪烁现象，没有完全开放事件，则无法测算电导。在人工质膜实验中，这种情况多表明通道蛋白纯化过程有问题。无论上述哪种方法，都需要先确定正确的基线，并对膜片漏电流进行去除，同时还要有一定的例数（膜片数）要求。,.,94,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,二、单通道开放概率的分析,分析开放概率之前，要先对开放事件进行检测。单通道事件的检测（1）事件检测前的准备工作基线调零、坏点去除、滤波等。（2）对检测参数进行设定（右图）（3）进行事件检测,.,95,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,Clampfit演示单通道开放事件的检测,.,96,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,单通道开放概率分析实例以机械敏感性MscL通道为例，单通道开放概率Po的计算过程如下：（1）打开单通道数据文件，进行数据处理（2）进行事件检测（3）计算Po（4）作压力-单通道开放概率关系曲线（5）对压力-单通道开放概率关系曲线进行拟合,Pressure-Po关系曲线,.,97,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,Clampfit中的拟合方程：Boltzmann,charge-voltage设：f(V)=Po，单通道开放概率Vc=1/，通道对负压的敏感度（mmHg），拟合获得的重要指标V=P，施加的负压值Vmid=P1/2，通道50%开放时的压力值，拟合获得的重要指标Imax=1，以通道100%开放为1C=0，Po的位移设为0则上述方程可以写成右侧的Boltzmann方程：,.,98,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,Clampfit演示单通道开放概率Po的计算,.,99,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,注意：单通道概率分析的前提是：能观察到膜片上全部通道开放的情况，进而知道膜片上通道的最大数目。,.,100,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,三、多通道开放概率,NPo的概念膜片上通道没有全部开放，通道总数N未知，Po无法计算，只能计算NPo多通道开放概率。单通道开放概率Po=NPo/N。压力Npo曲线用Boltzmann方程拟合。,.,101,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,拟合压力NPo曲线的Boltzmann方程：NPo：多通道开放概率NPomax：观察到的所有开启通道的最大开放概率=观察到的通道数：其倒数为通道对负压的敏感度（mmHg）P：施加的负压值。P1/2：通道50%开放时的压力值。拟合后，获得P1/2和1/。,.,102,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,不同组NPo的比较不同膜片NPo的平均不同膜片通道数不同，NPo和NPomax都不会相同。求NPo/NPomax（NPomax：给药前后两次记录中最大的NPo）。不同组比较方法：以压力-NPo曲线为例。（1）获得一个膜片给药前后不同负压条件下的NPo，求出NPo/NPomax。（2）求出所有膜片上的NPo/NPomax，得到药物施加前、后的两条压力-NPo曲线。（3）对曲线进行Boltzmann拟合，比较两组的P1/2和1/。,.,103,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,例子钳制电位=10mV，施加压力=-68mmHg，获得NPocontrol，然后给予糜蛋白酶(Chymotrypsin,300g/ml)，获得NPochymotrypsin。本例NPomax=4。求出该膜片的NPocontrol/NPomax和（NPochymotrypsin/NPomax）。求出不同膜片上的NPocontrol/NPomax和NPochymotrypsin/NPomax，进行统计学处理。,.,104,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,单通道I-V曲线的概念与意义通单道电流I大小与膜片两侧电压差大小（钳制电位Vm）之间的关系曲线。X轴：膜钳制电位Vm（mV）Y轴：单通道电流I（pA）意义：反转电位（Vrev）、斜率电导（Gs）。药物会影响通道性质，改变I-V曲线的形状和位置。,四、单通道I-V曲线,I(pA),Vm(mV),.,105,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,I-V曲线的制作在Clampex中获得不同歩阶电压（Vm）下通道电流I，保存为数据文件（.abf）。在Clampfit中打开该文件，开始制作I-V曲线：（1）对数据基线调零、坏点去除、滤波。（2）用Histogram功能和高斯拟合测算每个Sweep的单通道平均电流值I。（3）将平均电流值I与相应的歩阶电压Vm输入到Results窗口空白表格中。（4）用CreateGraph作图。（5）作回归曲线：选择“Straightline,standard”作为回归方程。（6）拟合结果：斜率电导m。Straightline,standard方程：,.,106,单通道I-V曲线的制作A,显示膜片在不同歩阶电压下通道电流的变化.膜片两侧液体相同.B,I-V曲线，反转电位为0mV，回归后单通道斜率电导Gs=3.34nS.数据来自脂质体上构建的细菌机械敏感性MscL通道，施加的负压稳定在-70mmHg.,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,.,107,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,注意如下几点：如果膜片上含有不止1个通道，且通道的开放概率太高，没有单个通道开放的情况出现，则无法进行回归。解决办法：（1）如果标本是人工质膜，应降低通道蛋白嵌入量，进而降低膜片上通道数目；（2）如果观察的是配体门控性离子通道，应该降低配体的使用浓度。,.,108,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,避免亚开放事件、闪烁事件被计入内。测量多个膜片，获得样本量n，求出平均的I-V曲线。由于膜片上单通道电流幅度的大小不受细胞大小的影响，故不用标化即可进行平均。,.,109,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,单通道开放时间的分析首先要作出通道开放时间的事件频数直方图，然后选择合适的指数方程对其拟合，求出开放时间分布的时间常数值（平均开放持续时间）。,五、单通道开放时间分布的直方图,.,110,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,单通道记录数据的分析,普通直方图X轴：通道开放时间Dwelltime(ms)，bin值Y轴：检测的事