第三章 核酸扩增技术

.,第三章,核酸扩增技术PolymeraseChainReactiontechniques,.,大纲要求：,掌握PCR的原理和反应过程掌握PCR反应体系掌握PCR产物的检测熟悉实时荧光定量PCR的原理和方法了解以PCR为基础的相关技术,Special,.,二、教学内容,第一节聚合酶链式反应第二节以PCR为基础的相关技术第三节PCR产物的检测第X节实时荧光定量PCR,现在位置P169,.,基础知识,遗传中心法则,现在位置P169,.,基础知识,.,基础知识,.,DNA加热变性,DNA冷却复性,一、核酸分子杂交的基本原理,基础知识,.,DNA变性(denaturation)定义：在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。,基础知识,.,基础知识,.,融解温度（Tm）定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度。,基础知识,meltingtemperature，,.,DNA复性,定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)。,基础知识,.,基础知识,.,基础知识,dNTPdATPdCTPdGTPdTTP,dNTP,.,PCR概念：在体外特异地复制一段已知序列的DNA片段的过程。,第一节聚合酶链式反应,现在位置P169,.,一、PCR的原理和反应过程,PCR反应重复进行DNA复制的过程，使DNA得以扩增，每一次复制包括3个步骤：变性（denaturation）退火（annealing）延伸（extension）,现在位置P125,.,变性（denaturation）,将待复制的双链DNA经加热至9495）左右一定时间后，DNA双螺旋的氢键断裂，使之成为单链分子，作为反应的模板（template)，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,现在位置P170,.,退火（annealing）,温度降低至寡核苷酸（oligonucleotide）引物的融点温度以下（4070），使引物能与模板互补结合，形成杂交链；,现在位置P125,.,延伸（extension）,将温度升至72左右，使反应体系中的DNA聚合酶按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTP加至引物的3端，使杂交双链不断延伸，以至形成新的DNA双链。,现在位置P125,.,PCR的基本反应过程,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,现在位置P170,（40-70C）,.,PCR的扩增效率,现在位置P170,循环次数：0123n产物数量：22222,0,1,2,3,n,每一次循环后，一分子模板被扩增为两个分子每个循环所产生的DNA片段，即为下一个循环的模板PCR产物量以指数形式增长,.,模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+,二、PCR体系基本组成成分,现在位置P170,.,模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPs缓冲液,二、PCR体系基本组成成分,现在位置P170,.,模板(template),模板就是将要被复制的核酸片段，包括基因组DNA、RNA、质粒DNA和线粒体DNA等。在用RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为PCR反应的模板进行扩增反应。,现在位置P125,.,耐热DNA聚合酶,TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）是从一种生活在热泉（8090）中的水栖噬热菌（Thermusaquaticus）中提取的，有很高的耐热稳定性。TaqDNA聚合酶的作用是催化DNA合成，即在模板指导下，以dNTP为原料，在引物的3-OH端,加上dNTP,在二者间生成3，5-磷酸二酯键，使DNA链沿53方向延伸。,现在位置P170,.,dNTPs,即dATP、dCTP、dGTP和dTTP四种脱氧核苷三磷酸的混合物。反应体系中4种核苷酸的浓度必须一致四种核苷酸间浓度的不平衡会增加反应时DNA聚合酶错配的机率。浓度过高会加快反应速度，但导致非特异性扩增降低在dNTP浓度会提高反应的特异性一般为20200umol/L,现在位置P170,.,镁离子浓度,镁离子浓度在扩增反应中是一个至关重要的因素，因为镁离子对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高TaqDNA聚合酶的活性有直接的影响。Mg2+浓度过低使酶活力降低Mg2+浓度过高又会使酶催化非特异性扩增。一般为1.5mmol/L,现在位置P172,.,引物(Primer),引物是化学合成的已知序列的寡核苷酸(oligonucleotide)分子。引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。,现在位置P170,.,引物设计时必须遵循的原则（6条）,用于PCR反应的引物需要二条，分别设在被扩增目标片段的二端，并分别与模板正负链序列互补。引物的长度一般以1825个核苷酸为宜引物过长容易产生寡核苷酸的链内互补，形成发夹状结构，引物过短则会降低扩增的特异性；,现在位置P171,.,引物设计时必须遵循的原则,二条引物之间（尤其在3端）的序列不可有互补，以免形成引物二聚体；引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积。CG的比例一般为4555%。,现在位置P171,.,PCR扩增中的退火温度是根据引物的Tm值而决定的，二条引物的Tm值不能差别太大。根据需要，合成引物时在其5端可以加修饰成分如加入酶切位点，用生物素、荧光素、地高辛等标记，引入突变位点，引入启动子序列，引入蛋白质结合DNA序列等。,现在位置P171,引物设计时必须遵循的原则,.,三、反应条件,1、温度变性温度：一般把变性温度定在9597之间，以使模板DNA和产物双链完全打开。退火温度：退火温度决定PCR反应的特异性，退火温度的设定取决于引物的Tm，通常PCR的退火温度应低于引物Tm5左右。延伸温度：一般为72，在这个温度下TaqDNA聚合酶具有较高的酶促活性，有利于DNA的复制。,现在位置P172,.,2、时间,PCR循环中每个步骤所需的时间取决于所扩增片段的长度。以长度为2001000bp的扩增片段为例，循环中变性、退火和延伸三个步骤的持续时间一般均为30秒1分钟。在模板（尤其是基因组DNA）进行第1次变性时应给予足够长的时间（57分钟，根据变性温度高低而异）以使模板彻底变性，然后再进入循环。时间过长会降低扩增的特异性。,现在位置P173,.,3、循环次数,循环次数一般为2045次。PCR扩增效率呈S型曲线，有平台效应平台效应的原因：初始模板量引物二聚体和反应产物抑制扩增反应体系的组份被消耗引物与模板DNA间竞争,现在位置173,.,四、PCR技术的质量控制,硬件方面实验室规范化设置软件方面样本采集核酸提取扩增产物分析测定结果的报送,现在位置P173,.,（一）实验室的规范化设置,临床基因扩增检验实验室必须包括四个工作区域：试剂贮存和准备区；标本制备区；扩增反应区；产物分析区。这四个区域必须互相独立，并严格按照上述顺序设置。每一区域都必须配置专用仪器，所用物品、试剂和耗材不得从某一个区域移至另一个区域使用。,现在位置P174,.,（二）PCR技术的质量保证,PCR技术用于临床检验的质量保证主要涉及基因扩增检验全过程的质量保证、室内质量控制和室间质量评价。,现在位置P129,.,（二）PCR技术的质量保证,样本采集核酸提取扩增产物分析测定结果的报送,现在位置P129,.,（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析,四、PCR的主要用途,现在位置P,.,第二节,以PCR为基础的相关技术,.,（一）逆转录PCR技术（二）巢式（三）定量PCR技术（）（四）多重PCR技术（五）PCR诱导定点突变（六）原位PCR技术（七）差异显示PCR技术（X）免疫PCR技术,现在位置P174,以PCR为基础的相关技术,.,（一）、逆转录PCR,逆转录PCR（reversetranscriptionPCR,RT-PCR）是以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。由于耐热的DNA聚合酶不能以RNA或mRNA作为模板，因此首先必须将总RNA或mRNA作逆转录，以生成与之互补的cDNA，然后再以cDNA作为模板进行PCR扩增，得到所需的目的基因片段。RT-PCR主要用于克隆cDNA、合成cDNA探针、检测RNA病毒和分析基因表达等。,现在位置174,.,（二）、巢式PCR,巢式PCR（nestedPCR）是对靶基因进行二次扩增。二次扩增所用的引物不能相同，第二次扩增所用的引物必须位于第一次扩增所用引物的内侧先用第一对引物扩增出一个较大的片段，再用第二对引物进行第二次扩增第二次扩增的模板是第一次扩增的产物,现在位置174,.,（二）、巢式PCR,现在位置174,引物1,引物2,nest,要扩增的目标基因,.,（三）、定量PCR,相对定量PCR定量PCR（实时荧光PCR）,现在位置175,.,（四）多重PCR技术,多重PCR（multiplexPCR）即在同一反应体系中加入多对引物，以同时扩增一份DNA样品中多个不同序列的靶片段。,现在位置P179,.,（四）多重PCR技术,多重PCR必须满足的两个条件：PCR反应条件适合所有被扩增的DNA片段同一反应内各扩增片段的大小应不同，以便检测时能通过电泳将各片段充分分离,现在位置P179,.,（四）多重PCR技术,现在位置P179,.,（四）多重PCR技术,现在位置P179,.,（五）PCR诱导定点突变,DNA重组技术使我们能够首先用各种方法对克隆的DNA片段进行突变，在对产生的突变作DNA序列分析以后，再对突变体的特殊功能作进一步研究。,现在位置P180,.,（六）原位PCR技术（insituPCR）,组织固定处理细胞内的DNA或RNA，并以其作为靶序列进行PCR反应的过程称为原位PCR。原位PCR与普通PCR的主要区别在于模板的制备。经脱蜡处理的组织切片或滴加在载玻片上的细胞悬液都可作为扩增样品，所有步骤均在载玻片上进行。,现在位置P134,.,（六）原位PCR技术（insituPCR）,进行PCR时，加入地高辛标记的的dUTP，使扩增产物带有地高辛。PCR结束，加入酶标抗地高辛抗体，再加入底物显色。,现在位置P134,.,（六）原位杂交PCR,原位杂交PCR与原位PCR的唯一区别：扩增结束后，用寡核苷酸探针与扩增产物作原位杂交。,现在位置P134,.,（七）差异显示PCR（defferentialdisplayPCR,DD-PCR）,现在位置P182,一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术。DD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗传学研究，是目前筛选基因表达差异最有效的方法。,.,.,（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）,结合PCR技术和抗原抗体反应用于检测抗原（蛋白质）固相载体上包被有抗体1抗体2上标记有DNA，作为PCR的模板,现在位置P134,.,（X）免疫PCR（Immuno-PCR,IPCR）,第一步：载体抗体1-抗原PCR,现在位置P134,.,.,（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）,IPCR的灵敏度是ELISA的100-10000倍,现在位置P134,.,第三节,PCR产物的检测DetectionofthePCRproduct,.,第三节PCR产物的检测,PCR完成以后，必须对扩增产物进行检测有效性和正确性：通过对PCR产物进行电泳分离，观察扩增条带的有无、扩增片段的大小等判断PCR反应的有效性和正确性。PCR产物定量：（专门章节讲）序列是否正确：测序,现在位置P185,.,一、PCR限制性片段长度多态性,是根据突变序列是否位于限制性内切酶的酶切位点内而设计的对PCR产物作限制性片段长度多态性分析的技术。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点二侧设计引物，使PCR产物含有该突变序列。一种检测点突变的技术，应用十分广泛。,现在位置P185,.,基因组中某个基因在同种生物的不同个体中，同时和经常存在的两种或两种以上的变异型，以至于用某种限制性核酸内切酶消化基因组的某段序列时，会呈现不同长度的消化片段，形成生物群体的多态性，这种多态性称为限制性核酸内切酶片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP),.,EcoRI,5-GAATTC-3,5-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-3,5-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-3,P1,P2,.,5-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-3,5-NNNNGAATTCNNN-3,5-NNNNNNNGTATTCNNNNNN-3,EcoRI,5-NNNNNNNGTATTCNNNNNN-3,EcoRI,+,_,+,_,.,RFLP的优缺点,RFLP用于检测点突变可以确定点突变的位置,.,二、等位基因特异性寡核苷酸,Allelespecificoligonucleotide,ASO是用寡核苷酸探针和PCR产物进行杂交以检测点突变的方法。被检基因片段经PCR扩增并经电泳分离后转移到膜上，分别与经标记的含有正常序列和突变序列的寡核苷酸探针杂交。PCR产物仅与完全互补的探针杂交,现在位置P185,.,野生型基因DNA,突变型基因DNA,野生型基因DNA探针,突变型基因DNA探针,.,野生型基因DNA探针,突变型基因DNA探针,结论：不存在点突变,.,野生型基因DNA探针,突变型基因DNA探针,结论：存在点突变,.,.,ASO的优缺点,用于检测点突变由于探针的序列是已知的，可以确定点突变的位置缺点是成本相对较高，检测一个点突变即需要一对引物和一对寡核苷酸探针,现在位置P185,.,三、单链构象多态性,单链构象多态性（Singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）当DNA分子以单链存在时，能在空间内自发地形成二级结构，这种二级结构的空间构象取决于DNA分子本身的的碱基构成，即使一个碱基的差别也会形成不同的二级结构。SSCP用于检测点突变缺点：不能确定突变的位置,现在位置P186,.,三、单链构象多态性,突变DNA的PCR产物经变性后产生与正常DNA空间构象不同的两条单链。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中时，不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率，从而能区别正常与突变的DNA。只适合于检测200bp以内的DNA靶基因片段实验的关键是控制各种条件以避免在操作过程中DAN单链分子复性为双链。,现在位置P186,.,四、变性梯度凝胶电泳,现在位置P186,DNA分子的物理特性之一是当DNA分子被加热至其融点温度时双链被打开。融点温度取决于DNA分子本身的序列，不同序列的DNA分子具有不同的融点温度。,.,变性梯度凝胶电泳技术正是利用了DNA分子的这一特性。在设计引物时使被扩增目的片段的二端含有不同的Tm值，一端较高，另一端相对较低。将这一PCR产物在由变性剂形成梯度的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，当其泳动至相应位置时，片段于Tm值较低一端的双链被部分解链，如此形成的构象至使该片段的电泳迁移率大大降低。,现在位置P186,.,变性剂浓度由低到高,Tm值低,Tm值高,.,变性梯度凝胶电泳的优缺点,变性梯度凝胶电泳技术用于检测点突变缺点：不能确定突变的位置,现在位置P186,.,Tm值的大小取决于DNA分子的长度和其序列中的G/C含量双链DNA可以结合荧光染料（SYBRGreenI）DNA复性时，荧光最强，随温度上升，荧光变弱，形成融点曲线。正常序列和突变序列因不同Tm而产生不同的融点曲线。,五、融点曲线分析,现在位置P137,.,温度,荧光强度,.,温度,荧光强度,.,优点：PCR产物不需要纯化，可以直接分析可以进行大批量样本分析，成本低结果重复性可达100%缺点：不能确定突变的位置,五、融点曲线分析,现在位置P137,.,PCR产物的序列分析主要用于分子克隆时对于目的基因扩增片段的序列鉴定对致病基因检测时分析扩增片段中点突变的位置和性质。,六、PCR产物的序列分析,现在位置P137,.,DNA自动测序,采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,.,DNA自动测序结果举例,目录,.,PCR产物序列分析的优缺点,优点：可以确定点突变的位置和性质缺点：成本贵,.,PCR产物分析方法的比较,.,拓展：PCR技术在分子诊断中的应用,分子诊断的定义就是用分子生物学技术通过检测被检测基因的存在与否、结构变化或表达异常，确定受检者有无基因水平的变化，并以此作为确认疾病的依据。分子诊断不仅能在疾病早期对患者作出确切的诊断，也能判别致病基因的携带者，确定个体对疾病的易感性并对疾病的分期、分型、疗效监测和预后作出判断。因此，分子诊断已成为检验医学的一个重要组成部分。,现在位置,.,目前分子诊断最常见的应用：,(1)鉴定位于众多正常细胞背景下的少量癌细胞；(2)鉴定具有发病风险的个体，以便及时采取有效的预防措施；(3)确定对特定治疗可能敏感的患者，避免不必要的治疗干预；(4)选择复发风险高、能从初期治