《原核表达系统》PPT课件

原核表达系统,*基因公司技术讲座*,原核表达系统分类,*基因功能研究*重组蛋白特性研究*重组蛋白制备/制药,主要用途,NEB公司的IMPACTTM系统,InteinMediatedPurificationwithanAffinityChitin-bindingTag,采用了最新的“可诱导的内含肽自身剪切”技术，使内含肽在适当的pH或还原条件进行自身剪切，无需另外加入蛋白酶就可将目的蛋白经过一步亲和层析从融合表达的蛋白中分离出来，大大提高了纯化效率。,世界首创独家提供,内含肽（Intein),内含肽是一种蛋白剪切元件（Proteinsplicingelement),是一些读框区中打断宿主基因编码区的序列。与内含子(Intron)不同的是，它们是在翻译后通过自身催化的蛋白剪切机制从蛋白前体中被剪切的。,InBase(TheInteinDatabase)NEBswebsite:TechnicalResourcesection,IMPACT-CN系统,特点,*操作灵活目的蛋白可在C端或N端与标记融合*目的蛋白产物序列不变*一步亲和纯化无需另加蛋白酶除亲和标记*严谨的转录控制*目的蛋白能够进行C端标记,独家的Intein介导的肽连接技术（IPL）,IMPACT-CN系统流程,IMPACT-TWIN系统,特点,*操作灵活目的蛋白可在C端或N端与标记融合*目的蛋白产物序列不变*一步亲和纯化无需另加蛋白酶去除亲和标记*可选择硫醇试剂或pH和温度条件诱导Intein自身剪切*IPTG诱导的T7启动子，可实现高水平表达及严谨的表达调控*唯一可直接产生带N端Cys和C端硫酯的蛋白的表达纯化系统纯化产物可方便地进行标记、连接及环化等操作,独家的Intein介导的肽连接技术（IPL）,IMPACT-TWIN系统流程,Proteincyclization,NEB公司的IMPACTTM系统载体选择,pMAL蛋白融合及纯化系统,特点,*表达量高，稳定可靠经验证，75%以上的样本产量高达100mg/L*产物可分布细胞质或周质空间分布周质空间可增强有二硫键的蛋白的折叠*与MBP融合可增加表达蛋白的溶解性*温和洗脱条件不用去垢剂及强烈变性,A1:未诱导细胞A2:诱导细胞,B1:直链淀粉柱第一次纯化B2:FactorXa处理后B3:直链淀粉柱第二次纯化,pMAL-C2:无信号顺序，融合蛋白产物定位于细胞质中pMAL-P2:含信号顺序，融合蛋白分泌表达于细胞周质,载体选择,PROBacterialExpressionSystem,-CLONTECH-,特点*严谨调控，高水平诱导表达新型的杂合启动子和操纵子，低背景，高表达，调控精确，可用于有毒或抑制生长的蛋白表达。*产物便于纯化N-端带有c-Myc亲和标记和肠激酶位点*改造方便载体的三个主要的功能区各配有单一酶切位点，用户可根据需要对载体进行改造。,PROBacterialExpressionSystem,-CLONTECH-,PROBacterialExpressionSystem,Simultaneous,independentexpressionoftwoproteinsThepPROTet.E332-lacZandpPROLar.A222-LucControlVectorsweresimultaneouslypropagatedinDH5PRO,-CLONTECH-,HATProteinExpression&PurificationSystem,-CLONTECH-,特点*可在中性pH条件下纯化蛋白有效去除杂质*纯化可采用变性或非变性条件降低蛋白酶活性，提高蛋白稳定性*提供纯化的专用树脂：TALONIMAC钴离子高度专一地亲和HAT和其它6His蛋白，且洗脱条件温和，保证蛋白完整性*pHAT-GFPuv载体还带有荧光标记极大的方便了表达产物的检测、定位及纯化,HATProteinExpression&PurificationSystem,-CLONTECH-,QIAexpress以6His标记和Ni-NTA亲和纯化为基础的完整的表达纯化系统,特点,*表达量高表达产物可占总蛋白的50%*严谨调控IPTG诱导的T5启动子，可表达有毒蛋白*基因克隆灵活：可选择N-端或C-端融合标记可选择一端或两端6His标记*纯化方便：一步纯化可选择变性或不变性条件可选择多种灵敏的检测方法,QIAexpress以6His标记和Ni-NTA亲和纯化为基础的完整的表达纯化系统,QIAexpress以6His标记和Ni-NTA亲和纯化为基础的完整的表达纯化系统,QIAexpress以6His标