《凝胶电泳》PPT课件

第二节基因操作的主要技术原理,凝胶电泳扩增原理分子杂交DNA测序生物芯片,一、凝胶电泳它是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳脉冲电场凝胶电泳,1、基本原理,带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。,DNA的迁移速率决定因素,1DNA分子的大小双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比；2琼脂糖浓度浓度越低，相同核酸分子迁移越快；3DNA的构象一般同一分子：超螺旋环状线状切口环状。,4凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。5所用的电压低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。6琼脂糖种类常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；,凝胶电泳的分辨力：与凝胶的类型和密度相关琼脂糖凝胶的分辨力在0.250Kb之间;聚丙烯酰胺的分辨力在11000bp之间,SeparationRangeVs.%Agarose,LowGelingAgarose4-60.02-0.4,不同类型琼脂糖的性质,AgaroseGelElectrophoresis琼脂糖（agarose）是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷,2、琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。,D-半乳糖,3，6-脱水-L-半乳糖,琼脂糖凝胶的特点,（一）优点1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定6.有热可逆性,（二）缺点1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。,分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP）琼脂糖。（1）LMP琼脂糖熔点：6265熔解后，在37可保持液态数小时；在25可保持液态约10min回收DNA操作：将凝胶在65下加热数分钟，再向液态琼脂糖中加入过量酚液抽提DNA，经离心获得含DNA分子的上清液，酶切DNA片段后电泳。,（2）琼脂糖凝胶电泳的参数：,缓冲液：1TAE（TBETPE）凝胶的含量：根据检测的DNA大小加DNA样品：1g，指示剂溴酚蓝电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间(5V/cm),（2）琼脂糖凝胶电泳的参数：,染色和观察：溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪），能看到0.05g的微量DNADNA的片断大小与荧光强度成正比,操作,预染色的标本,用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算,SampleWell25ng1kbladder0.8%Agarose,1,2,4,6,8,10,12,kb,AgaroseGelElectrophoresisEtBrDetectionLimit:5-10ngDNA,Agarosegelelectrophoresis,Agarosegelelectrophoresis,【注意事项】,1.琼脂糖融化时，档位不宜太高。2.制胶和加样过程中要防止气泡的产生。3.EB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。4.加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或DNA带型不整齐。5.电源接通时，应核实凝胶的方向是否正确。6.电泳仪有电压显示，并不一定标志电泳槽已接通，应观察电极气泡出现情况。负极的气泡比正极多一倍，表示电泳已开始。7.溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中，在紫外光的照射下，插入溴化乙锭的DNA呈橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作为荧光指示剂指示DNA含量和位置。,3、聚丙烯酰胺凝胶电泳,PolyacrylamideGelElectrophoresis，PAGE-,原理,聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(N，N，N，N-tetramethylethylenediamine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vitaminB2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。,丙烯酰胺,N,N-甲叉双丙烯酰胺,原理,聚丙烯酰胺凝胶三维结构,聚丙烯酰胺凝胶电泳种类,1变性聚丙烯酰胺凝胶用于单链DNA片段的分离或纯化。变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。,2非变性聚丙烯酰胺凝胶用于双链DNA片段的分离和纯化。注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。用途：制备高纯度的DNA片段。,（三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围,注:N,N-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30;,Home,图.1夹心垂直板电泳槽示意图1.导线接头2.下贮槽3.凹形橡胶框4.样品槽模板5.固定螺丝6.上贮槽7.冷凝系统,图.2凝胶模示意图1.样品槽模板2.长玻璃板3.短玻璃板4.凹形橡胶框,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。,3、聚丙烯酰胺凝胶电泳,PolyacrylamideGelElectrophoresis，PAGE缓冲液：TBE凝胶聚丙烯酰胺电泳：丙稀酰胺/亚甲双丙稀酰胺（29：1）；TEMED（四甲基乙二胺，加速剂）过硫酸铵（10，催化剂）。,垂直板电泳装置,加样,样品迁移方向,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,夹在两块玻璃板之间的凝胶,电泳缓冲液,电泳缓冲液,加在槽中的经SDS处理的样品,分子量小,分子量大,电源,电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片,水平式电泳装置,电泳缓冲液,凝胶,PAGE的特点,1.具有分子筛效应，分辨率高2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10-6g3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明6.网孔可调节,4、脉冲电场凝胶电泳（PFGE）,1984年，D.R.Cantor发明的。分离超大分子量的DNA分子。在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45度角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45度角。,脉冲电场电泳示意图,脉冲场凝胶电泳原理图,北,南,脉冲场电泳常规电泳两组电极，排列不均匀;一组电极，电场方向不变，电极排列均匀，定时改变电场方向，DNA分子的净DNA移动方向与电场方向相同。整个电泳移动方向与两电场呈45o，在电泳过过程保持电压稳定。常规方法制备DNA程中，电压有时可随时间的增加而样品增加，制备DNA样品与常规方法不同,4、脉冲电场凝胶电泳（PFGE）,由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。,PFGEcanresolvelargeDNAfragments,类型,垂直脉冲场电泳系统(verticalpulsedfield)场翻转系统(fieldinversion)旋转胶系统(rotatinggel)箝位匀强电场系统(contour-clampedhomogeneouselectricfield)动态调控闭合均一电场电泳,垂直交变电场系统,场翻转系统,箝位匀强电场系统,旋转胶系统,影响分辨率的因素,1脉冲时间（0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较大分子，减少脉冲时间分离较小分子。2电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度会导致较小片段泳动的紊乱。,3电场夹角：电场方向的夹角常为1100-1200，研究证实900夹角也非常有效的。4温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，PFGE一般应在4进行。较高的温度DNA泳动较快；但是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显的条带变宽。,种类1)按凝胶材料分:聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳(普通琼脂糖和低熔点琼脂糖)2)按电泳装置分:水平式/琼脂糖凝胶;竖式/聚丙烯酰胺凝胶3)两种方法比较：分离效果和分离范围;操作难易2.用途琼脂糖凝胶用于DNA和RNA的常规分析；聚丙烯酰胺凝胶常用于小分子核酸分析。3.凝胶电泳的一般程序制胶点样电泳染色观察DNA电泳1.DNA分子种类1)线状DNA单链与双链，ss-DNA电泳时要注意局部区域形成ds-DNA，造成迁移距离不确定2)环状DNA单链（如M13mp）和双链（质粒DNA）3)线状ds-DNA电泳使用频率最高的一种电泳,这类DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素的影响：i.分子量的大小:迁移距离与分子量的常用对数成反比ii.凝胶浓度:浓度越高，移动距离越短，适合分离低分子量DNA浓度越低，移动距离越长，适合分离高分子量DNA,iii.电压:低电压时，迁移率与电压成正比；电压增高时，不同大小DNA片段迁移率增大是不同的。iv.碱基组成与温度:不受影响,温度高可导致DNA带变形或解链。,4)环状ds-DNA电泳:常用于质粒DNA的初步鉴定5)线状ss-DNA电泳链分离凝胶：化学定序时，用于单链分离。DNA双链互补，但组成不一样，仍可分离（机理不详），电泳时形成三条带：变性双链，两条单链。,核酸定序凝胶(染料指示剂)：为避免局部区域产生二级结构，可采用各种变性措施，如煮沸样品，提高电泳温度，凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等）,RNA凝胶电泳方法：不同的RNA电泳方法是依据使RNA分子变性所采取的方法。这些方法不仅要使RNA分子在点样时是一级结构，而且在整个电泳过程中也保持一级结构。1.乙二醛/二甲基亚砜法原理：乙二醛可以与核酸、核苷酸及碱基发生反应，特别是鸟苷形成一个稳定的附加环，从而阻止GC碱基的互补作用发生步骤：RNA+10mM羟甲基醛和50%DMSO混合50、1h变性点样电泳染色观察2.羟甲基汞法原理：羟甲基汞可与RNA分子的嘌呤或嘧啶碱基发生反应，反应部位是在可形成氢键的亚氨基处。步骤：RNA+10mM羟甲基醛点样在含4mM羟甲基醛的琼脂糖凝胶上电泳染色观察,3.甲醛法步骤：RNA+2.2M甲醛+50%甲胺点样在含2.2M甲醛琼脂糖凝胶上MOPS缓冲液电泳染色观察其它变性剂，如尿素、甲胺等也可用于RNA电泳.4.三种方法的比较第一种方法安全，但由于反应是不可逆的，由此回收的RNA样品用于体外翻译效果不好。第二、三种方法的反应可逆，回收RNA样品可用于体外翻译反应，但操作必须小心，因两种变性剂有毒。蛋白质电泳方法：变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者常称之为SDS-PAGE。差别：有无变性剂用途：非变性凝胶可用于蛋白质的分离纯化过程中，可直接用于酶促反应（颜色变化）SDS-PAGE可用于蛋白质分子量、亚基组成的测定。mRNA翻译产物，基因表达产物测定等。,核酸片段的分离与回收1.方法用于DNA、RNA以及蛋白质的回收1)电洗脱法:利用电泳方法将凝胶中的特定核酸分子到其它介质中；2)滤纸法核酸凝胶染色长波紫外光确定位置在分离带前方切一口子并插入滤纸条(其背面覆盖透析袋膜)电泳至DNA带全部进入滤纸条洗脱DNA纯化、沉淀3)透析袋法切下含DNA带琼脂块放入透析袋，封口放入电泳槽电泳23小时至全部DNA离开凝胶块反向电泳1分钟取出DNA液纯化、沉淀4)冻融法5)酶解法,回收DNA方法,影响回收率的因素1）DNA分子大小回收率与分子量大小呈负相关；2）乙醇沉淀其中温度、时间和DNA浓度（回收时体积）均与回收率有关；3）离心时间时间越长，效果越好，对低浓度DNA尤其明显。回收DNA片段质量凝胶材料的质量，如琼脂糖中的硫酸盐沉淀剂若改用精胺，它可有效地去除PEG、核苷酸、盐、聚丙烯酰胺及蛋白质等。,二、基因扩增（geneamplification）,主要内容：1.体外扩增2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿主细胞进行扩增3.在环境作用下，生物体内相关保卫基因的扩增。4.程序基因扩增5.进化过程中的基因扩增,三、分子杂交,分子杂交：指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。由于操作方式相似，通常将检测蛋白质的抗原抗体反应也看作是分子杂交。作用：用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质是否存在，以及其相对分子质量的大小。分类：根据检测对象的不同可分为Southern杂交、Northern杂交、Western杂交。,Southern杂交：即DNA-DNA杂交分析，检测样品中特定的DNA及其含量。Northern杂交：即RNA-DNA杂交分析。检测样品中是否含有特定基因的转录产物（mRNA）及其含量。Western杂交：即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。,核酸分子杂交（DNA/DNAorDNA/RNA）技术核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事发明的。所依据的原理是，具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。探针,HybridizationofNucleicAcids,RNA,DNA1,DNA2,DNA,Southernhybridization,Northernhybridization,JuangRH(2004)BCbasics,探针,DNA变性与复性1.DNA变性定义：氢键断裂，单链方法:热变性:90100熔解温度(Tm)酸碱变性:常采用碱变性化学试剂变性;尿素、甲醛等2.DNA复性(退火)DNA/DNA，DNA/RNA，RNA/RNA,分子杂交的基本方法,Southern印迹法Northern印迹法斑点印迹杂交原位杂交Western印迹法液相杂交,固相杂交,杂种核酸分子：彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，而形成的双链分子。DNA/DNA的杂交作用检测特定生物有机体之间的亲源关系DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片断中某种特定基因的位置。,核酸杂交常用几种膜的性能比较,硝酸纤维素膜不能滞留小于150bp的DNA片断，不能同RNA结合。应用1mol/L醋酸铵和0.2mol/L的NaOH缓冲液代替SSC缓冲液可改善对小片断DNA的滞留能力。RNA变性后也能十分容易的结合到膜上。,尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤：1.核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。利用的是(毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法)2.印迹杂交：将具有核酸印迹的滤膜同带有标记的DNA/RNA进行杂交。,1、萨瑟恩DNA印迹杂交根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫SouthernDNA印迹转移技术。,Southern凝胶转移杂交技术,杂交步骤：1.酶切2.电泳3.转膜4.杂交5.显影,SouthernBlotting的过程1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA3.固定胶中的DNA4.预杂交、杂交（放射性和荧光检测5.结果检测,电转印法,在理想条件下，应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即便每带电泳条带仅含有2ng的DNA也能被清晰地检测出来。由于放射性同位素对人体的危害，近年来又发展了荧光法检测杂交信号的技术，虽然灵敏度略低于同位素法，却使核酸杂交实验变得更为安全。,SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片水稻（OryzasativaL.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶Bgl(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G-I）、和Hind（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列。,在进行核酸印迹转移的时，1.要将以转好的硝酸纤维素膜在80度下烘烤12小时；2.紫外线交联法，将DNA分子上的部分胸腺嘧啶残基同尼龙膜表面的带正电荷的氨基基团之间进行交联。,2、诺赛恩RNA印迹技术（Northernblotting）1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northernblotting）。而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Westernblotting）。,1)转移的对象不同，Northern印迹转移的是RNA，Southern印迹转移的是DNA。2)电泳前的处理不同，RNA在电泳前需要甲醛变性处理，DNA在电泳前不必变性处理。3)电泳后的处理不同，RNA在电泳后可直接转移到固相支持物上，DNA在电泳后需要经过碱变性处理及相应的中和处理。,Northern印迹杂交法和Southern印迹杂交法有何不同,Western杂交,Westernblotting是用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素膜或其它支持物上，然后同放射性同位素标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术广泛用于基因在蛋白质水平上的表达研究。,3、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交斑点印迹杂交（dotblotting）和狭线印迹杂交（slotblotting）是在Southern印迹杂交的基础上发展的量种类式的快速检测特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置，使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技术更适应与核酸样品的定量检测。,通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器上的核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上。,4、菌落杂交也叫原位杂交，是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，使溶菌的DNA同滤膜原位结合，带有DNA的滤膜烘干后，与放射性同位素标记特异的DNA或RNA探针杂交。鉴定重组子。,检测重组体克隆的菌落杂交技术,核酸原位杂交(insituhybridization),1.定义：将标记的探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交检测的方法。2.特点：能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态,核酸原位杂交的基本步骤,1.细胞或组织的固定：载玻片2.组织细胞杂交前的预处理用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质3.探针的选择和标记4.杂交5.杂交结果检测,1.荧光染色体原位杂交(FluorescenceinsituHybridization；FISH)基本原理是将DNA探针用荧光染料标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体上，来检测DNA序列在染色体上的定位。2.多色荧光染色体原位杂交(multicolorFISH;mFISH)3.比较基因组原位杂交(ComparativeGenomicHybridization；CGH),由原位杂交发展起的一些新技术,3.比较基因组原位杂交(ComparativeGenomicHybridization；CGH)利用两种不同的荧光分別标记两种不同細胞的GenomicDNA，再同时与正常的染色体进行hybridization，染色体上不同荧光间的强弱比值，由此比较而观察基因组中特定基因的拷贝数变化。CGH主要用于检测肿瘤组织DNA拷贝数变化（缺失、复制、扩增），并能将这些异常在染色体上定位。该方法通过同一次实验即可扫描整个肿瘤基因组DNA序列的增加或丢失。,液相