chapter-04-表达载体.ppt

据受体细胞的不同可分为：1原核表达系统：将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。2真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。,第四章表达载体ExpressionVectors,必须满足克隆载体的基本要求；载体自主复制的起始位点序列ori；多克隆位点MCS；筛选标记基因；启动子/终止子；核糖体结合位点,第一节原核表达载体Prokaryoticexpressionvectors,1、大肠杆菌表达载体的结构,基因表达在原核生物与真核生物中的差别？,在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行的。当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的mRNA，与此同时，mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被水解。在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5和3末端后才形成mRNA。而mRNA只能在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。,2、基因表达的调控元件,启动子（promoter）：是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，它位于基因的上游。RNA聚合酶正是通过与它的结合而启动基因的转录。原核基因启动子具有10和35序列等结构元件，而真核基因启动子则具有TATA盒及上游元件等特征结构。启动子的特征:,序列特异性方向性位置特性种属特异性,3、在大肠杆菌表达的形式,表达形式：不溶性蛋白和可溶性蛋白两种。不溶性蛋白-包涵体形式存在的蛋白包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。可溶性蛋白可溶性蛋白：可以溶于细胞质的蛋白。,Lac：受Lac阻遏蛋白负调控，受IPTG的诱导Trp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。Tac：Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受噬菌体CI基因负调控。温度诱导。T7：利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统元件，它具有很高的表达能力。,（1）常见原核强启动子,1）融合型表达载体：-融合蛋白2）非融合型表达载体：-天然完整蛋白3）分泌型表达载体：-产物可跨膜分泌至胞周间隙,（2）原核表达载体类型,1）融合型表达载体,克隆基因插入原核基因序列3端而维持正确阅读框架。,技术关键,AATCGGAAGAATTCAGACCTAGGTTTAGCCTTCTTAAGTCTGGCTCCA,载体部分序列,DNA序列,融合蛋白,融合蛋白将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。,表达效率高产物稳定易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定易纯化：利用融合原核多肽的特性,融合蛋白表达的特点或优点:,Tac：IPTG诱导GST融合蛋白直接纯化产物切割方便：pGEX-1T凝血酶pGEX-2T-凝血酶pGEX-3T-X因子位相载体,融合型载体-pGEX系列,位相载体-含有3种读码框的系列载体,主要元件：强启动子；SD；ATG：第一个密码子,2）非融合型表达载体,PL启动子-温度诱导插入位点-HpaI,非融合型表达载体-pPL-Lamda,1、主要元件：启动子和SD序列信号肽序列：SD下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜2、优点：分泌表达，避免降解。,3）分泌型表达载体,分泌型表达载体-pINIII-ompA1,分泌型外源蛋白：外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白。外源蛋白以分泌型蛋白表达时，须在N端加入1530个氨基酸组成的信号肽（signalpeptides）序列。信号肽N端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部为疏水氨基酸，它们对蛋白质分泌到细胞膜外起决定性作用。当蛋白质分泌到位于大肠杆菌细胞内膜与外膜之间的外周质时，信号肽被信号肽酶所切割。,分泌型蛋白形式表达外源基因的优点,分泌型可能使蛋白质按适当的方式折叠，有利于形成正确的空间构相，获得有较好生物学活性或免疫原性的蛋白质。甚至有些在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌后则有活性。分泌到细胞外周质的蛋白质产物较稳定，不易被细胞内蛋白酶所降解。简化了发酵后处理的纯化工艺。,缺点：外源蛋白分泌型表达通常产量不高，有时信号肽不被切割或在不适当的位置发生切割。,温度诱导表达载体,E.coli表达载体的基本结构特征,酵母细胞表达载体植物细胞表达载体哺乳动物细胞表达载体,第三节真核生物表达载体Eukaryoticexpressionvectors,特点：源于酵母的启动子/克隆位点筛选标记：营养缺陷型Leu、Trp、His、Lys、终止子序列：穿梭载体(shuttlevector)：是一类既可以在原核细胞中复制，又可以在真核细胞表达的载体。整合型表达载体：整合介导区表达产物：分泌型表达载体胞内表达载体,一、酵母表达载体Yeastexpressionvectors,3.6kb,分泌型表达载体具有AOX1启动子Zeocin抗性标记基因AOX1下游有多克隆位点多克隆位点下游有AOX13终止序列；含有强分泌信号肽：-factor,2、巴氏毕赤酵母（pichiapastoris),1、酵母宿主菌细胞,目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母汉逊酵母属如多态汉逊酵母其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想,真核生物与原核生物催化转录、翻译及其后修饰的酶和起始复合物的结构不同，医学研究需要能表达真核生物基因的表达载体。由于病毒对宿主细胞有依赖性和可整合性，真核表达组件不少来自病毒。如腺病毒，巨细胞病毒（CMV）启动子，猿猴空泡病毒SV40的组件等。,二、哺乳动物细胞表达载体Mammaliancellexpressionvectors,1、带有真核生物基因表达组件的质粒,瞬时表达：外源基因进入受体细胞后，未整合进受体细胞基因组而立即转录，出现基因产物。即瞬时转染后的初期，质粒或DNA片段是游离在细胞中的，能够进行表达，成为瞬时转染表达。一般随载体进入细胞后24小时内就可以表达，并持续约96小时左右。,2、真核生物基因表达方式,一般包括：基因的转录元件，即转录的启动子、增强子、终止子、poly(A)信号和内含子剪接信号等；用于筛选转化子的选择标记；在细菌中进行复制和筛选的元件；基因表达的调控元件。,3、表达载体组成元件,复制子,一般采用病毒基因组的复制子，带有这些复制子的表达载体能以附加体的形式进行复制。常见的复制子有SV40、多瘤病毒和牛乳头瘤病毒等的复制子。不同表达复制子的效率是不相同的。,启动子和增强子,长为100200bp，位于转录起始位点上游，一般由核心启动子和上游启动子两部分组成。目前构建的哺乳动物基因表达载体的启动子，主要来源于病毒，如SV40早期和晚期转录启动子、腺病毒晚期启动子等。病毒载体的增强子位于转录起始位点的上游，它可大幅度提高启动子的转录水平。多数增强子具有宿主特异性。,终止信号和加poly(A)信号,RNA聚合酶的转录终止和加poly(A)信号依赖于DNA模板上两种特异的序列，一是位于poly(A)位点上游1130个核苷酸的一段高度保守的六核苷酸序列AAUAAA；二是poly(A)位点下游的GU丰富区或U丰富区。因此，在构建表达载体的时候必须加上这两种序列。常用的加poly(A)信号来自SV40，它是一段长为237bp的BamHI-BclI限制酶酶切片段，它同时含有早期转录和晚期转录单位的切割信号与加poly(A)信号。,剪接信号,mRNA剪接所必需的最短序列位于内含子5和3边界上。在构建真核表达载体时都组入一个SV40的内含子，利用该内含子及其剪接信号构建的载体，表达外源基因的水平比普通的载体要高。,选择标记基因,为了快速有效地筛选哺乳动物转化细胞，必须在构建表达载体时组入动物细胞特异性选择标记基因。目前已发展的哺乳动物细胞基因转化筛选标记如下表所示：,GT-AG法则,不带真核复制起始序列的质粒型载体带真核病毒调控序列元件的质粒表达载体SV40衍生的表达载体牛乳头瘤表达（BPV）衍生载体人疱疹病毒（EBV）衍生的表达载体人腺病毒（adenovirus）衍生的表达载体反转录病毒（retrovirus）衍生的表达载体,4、哺乳动物基因表达载体,哺乳动物基因表达宿主细胞选择的基本原则：来源丰富、转化效率高、表达效果好。在哺乳动物基因表达过程中，与正常细胞生理特性尽可能接近的肿瘤细胞常被选择为基因转移的受体细胞。目前用作哺乳动物基因表达系统的受体细胞主要有：CHO-K1细胞、COS细胞、鼠骨髓瘤细胞等。,5、哺乳动物基因表达宿主细胞,CHO-K1细胞,CHO-K1细胞是从中国仓鼠卵巢中分离出的一株上皮细胞。目前被用于基因表达的受体细胞是一株缺乏二氢叶酸还原酶（dhfr）的突变株，它可在氨甲蝶呤选择压力下，使外源基因拷贝数扩增并得到较高水平的表达，表达量可达10g/ml以上。,在没有选择压力下，外源基因能稳定保持；适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达；对培养基的要求较低，可在无血清培养基中培养；细胞可进行贴壁培养，也可进行大规模悬浮培养。,该细胞株是目前应用最广泛的哺乳动物基因表达受体细胞之一，已有多种外源基因如人组织型纤溶酶原激活剂（tPA）、干扰素、干扰素、凝血因子等在CHO细胞中得到表达。,CHO-K1细胞特点,它来源于非洲绿猴肾细胞系，能组成性表达SV40的大T抗原。,COS细胞的特点：,细胞来源丰富；细胞易于培养和转染；能使转染到该细胞中的带有SV40复制子的转录载体快速扩增；能瞬时大量表达外源基因的产物。,由于转染质粒在COS细胞中无节制复制，最终将导致细胞无法忍受而死亡。利用COS细胞作为外源基因瞬时表达的受体细胞可广泛用于哺乳动物基因的表达与调控、蛋白结构与功能分析等研究。,COS细胞,鼠骨髓瘤细胞如Sp2/0、NSO和J558L等已被用作基因表达的受体细胞。目前已有免疫球蛋白（Ig）、tPA等多种外源基因在鼠骨髓瘤细胞中得到表达。,鼠骨髓瘤细胞的特点：,细胞易于培养和转染，可在无血清培养基中进行高密度悬浮培养；能进行分泌表达，且表达量高；能对蛋白质进行糖基化修饰。,鼠骨髓瘤细胞,载体启动子的强度和宿主范围，是外源基因高表达的关键因素之一，选择强启动子可获得高效表达。外源基因的表达水平与细胞中基因的拷贝数有关，拷贝数对于瞬时表达系统尤为重要。为此，可考虑将载体构建为一种自主复制型载体。将外源基因与选择标记基因的表达结合在一起，使细胞在选择压力下培养时，两种基因产物都能获得高表达。,提高哺乳动物基因表达系统表达效率的策略,（1）设法提高外源基因的表达水平和产量,方法包括：,宿主细胞的特性对外源基因的表达至关重要。以一种或几种宿主细胞表达不同特性和要求的外源蛋白是不够的。因此，根据表达载体和外源蛋白的特性，对宿主细胞进行改造，或采用一些新的宿主细胞系统，对提高外源基因的表达水平有重要作用。,（2）改造宿主细胞的特性,为细胞生长提供足够的营养和充分的氧源；加入抗氧化剂延缓细胞凋亡；将抗细胞调亡基因导入宿主细胞中。,（3）抑制细胞凋亡，延长细胞周期,方法包括：,哺乳动物蛋白的一个重要特点是糖基化，而糖基化的方式决定蛋白质的特性。蛋白质糖基化的方式有两种（N-糖基化和O-糖基化）。决定蛋白质糖基化的主要因素包括宿主细胞内糖基化酶和细胞的培养环境等。,（4）提高表达蛋白糖基化水平,用不同的哺乳动物宿主细胞（含人类细胞），使表达的蛋白与人类天然蛋白的糖基化相同或相似；通过基因工程改造现有的宿主系统，将某些糖基化酶引入宿主细胞中，使其对表达蛋白进行有效糖基化；对哺乳动物细胞表达条件进行改进，使有利于表达蛋白的糖基化。,方法包括：,通过DNA同源重组，使细胞特定的内源基因被破坏而造成其功能丧失或在基因组特定的位点插入外源基因。,1.基因打靶（genetargeting）,基因敲出（knock-out）,基因敲入（knock-in）,第四节基因打靶载体（Targetingvector）,2.基因打靶载体的要求,1.要求能整合到染色体上特定的位置。,2.整合的位置尽量选在基因组内编码非必需产物的地方。,3.必须整合在基因组中可以转录的区域。,定点整合,1.两段同源DNA序列（HB1和HB2）,2.目的基因,3.基因打靶载体组成,3.编码抗G418的基因（neor）,4.胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2）,与靶位点两端的区域同源,新霉素（neomycin）磷酸转移酶基因,分别来自I型和II型单纯疱疹病毒（HSV）。,载体,tk1,HB1,neor,目的基因,HB2,tk2,载体,4.载体的整合方式,染色体DNA,HB1,染色体DNA,HB2,染色体DNA,载体,tk1,HB1,neor,目的基因,HB2,tk2,载体,染色体,tk1,HB1,neor,目的基因,HB2,tk2,染色体,两个tk基因至少有一个可能整合到基因组里。细胞被tk基因杀死。,1.非特异整合非同源重组,2.特异位点整合同源重组,载体,tk1