菌体收集与干燥

.,1,菌体收集与干燥,将培养到期的培养物（要求生孢率达90%以上）经过纯菌试验，确认无杂菌污染。将上述培养物4000rpm/min转速离心20分钟，弃上清，收获湿菌体。将湿菌体与无水碳酸钙以1：3（重量比）混合搅拌成湿菌粉。在7080条件下干燥，并研磨、过筛制成粉末状菌粉。,.,2,菌粉的鉴定,5.1外观5.2目的菌检验5.3干燥失重5.4活菌数测定,.,3,5.1外观采用肉眼观察，应为白色，灰白色或灰黄色粉末。5.2目的菌检验取少量菌粉加入适量灭菌生理氯化钠溶液或其他适宜稀释液以后，涂布在适宜的琼脂平皿上，在适宜条件下培养，其培养物的生长特性和染色镜检的特征应符合生产用菌种特征。5.3干燥失重按仪器方法测定，除另有规定外，芽孢菌制品的减失重量应不得超过7.0%。,.,4,5.4活菌数测定,无菌称取3.0g菌粉（胶囊取内容物），加入27.0ml稀释液中，充分摇匀，做10倍系列稀释（最终稀释度根据不同的指标要求而定）。取最终稀释度的菌液100l，滴入选择性琼脂培养基平皿上，共做3个平皿，并以玻棒涂布均匀，置适宜条件下培养，到期观察每个平皿菌落生长情况，并计数。当平皿菌落数小于10或大于300时，应调整最终稀释度，重新测定。根据3个平皿菌落总数按下列公式计算活菌数：活菌数（CFU/g）=3个平皿菌落数之和/3*10*最终稀释度,活菌数应大于等于200亿个活菌/克,.,5,【附注】（1）活菌数用“CFU”表示，即为细菌集落单位。（2）稀释液使用灭菌生理氯化钠溶液或其他适宜的稀释液。（3）选择性琼脂培养基，是指最适宜制剂（或菌粉）中活菌生长的培养基。须经批准后方可使用。,.,6,胶囊制备,将上述原菌粉与灭菌过筛（筛孔为80目）地乳糖、可溶性淀粉按下述重量比混合：原菌粉2份，乳糖10份、可溶性淀粉88份，并充分搅匀，其中上述菌粉混合物的活菌数控制在1108个活菌数/克。将菌粉混合物置于胶囊灌装机内罐装，压板、包装，制成枯草芽孢杆菌胶囊制剂，其中每粒胶囊为0.25克/粒。,.,7,成品鉴定,7.1鉴别试验7.2理化检查（外观、干燥失重、装量差异、崩解时限）7.3活菌数测定7.4安全试验,.,8,7.1鉴别试验检查成品中所含的目的菌是否符合生产用菌种的特性。即按上述“种子批的检定”方法进行生长特性、染色镜检和生化反应检查，应符合规定。,.,9,7.2理化检查,7.2.1外观胶囊剂内粉末的粒子大小、色泽应均匀，间有菌粉色斑。7.2.2干燥失重按仪器方法测定，除另有规定外，芽孢菌制品的减失重量应不得超过7.0%。,.,10,7.2.3装量（重量）差异取供试品20粒，分别精密称定质量后，倾出内容物（不能损失囊壳），硬胶囊壳用小刷或其他事宜的用具（如棉签）拭净，再分别精密称定囊壳质量，求得每粒内容物装量与平均装量。每粒装量与平均装量相比，超出限度差异的胶囊不得多于2粒，并不得有1粒超出装量差异限度的1倍。,胶囊剂的装量差异限度：0.3g以下在10以内,.,11,7.2.4崩解时限硬胶囊或软胶囊，除另有规定外，取供试品6粒，按片剂的装置与方法进行检查（使用崩解篮）。硬胶囊应在30分钟内全部崩解并通过筛网（囊壳碎片除外），如有1粒不能完全崩解，应另取6粒复试，均应符合规定。,.,12,7.3活菌数测定见“菌粉”的活菌测定,.,13,7.4安全试验,安全试验是通过动物试验进行的非特异性毒性检查，应根据制品的使用途径和人用剂量确定试验方法。肠道微生态活菌制品检查：称取2g制品，加入8ml生理氯化钠溶液中，混合均匀。用5只体重1822g小鼠，每只小鼠经口灌胃0.5ml，每