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环介导等温扩增技术,胡星星201505112015.10.20,.,2,主要内容,定义原理操作步骤优缺点及,.,3,定义,环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是指在等温（60-65）条件下，利用链置换DNA聚合酶短时间（通常1h）内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。其检测结果可直接肉眼观察白色沉淀或者绿色荧光，是一种适合现场、基层快速检测的方法。,.,4,原理,.,5,.,6,扩增启动阶段,FIPF3,（5）:有1个环状构造（Fc1末端5端游离）的单链,BIPB3,（8）:有2个环状构造（F1末端即3端游离和Bc1末端即5端游离）的单链,.,7,.,8,循环扩增阶段,FIPF1末端延伸至形成一个环状构造（B1末端即3端游离）；FIP退火到茎环结构（8）上，引导链置换DNA合成反应，产生结构（9）的产物；随后产物（9）的B1末端即3端自动引导链置换DNA的合成，生成产物(10）和茎环结构（8）（与开始的产物（8）序列互补的）；BIPB1末端延伸至形成一个环状构造（F1末端即3端游离）；BIP退火到茎环结构（8）上，引导链置换DNA合成反应，产生结构（9）的产物；随后产物（9）的F1末端即3端自动引导链置换DNA的合成，生成产物(10）和茎环结构（8），产物（8）开始新一轮的循环扩增。,.,9,延伸循环步骤,产物(10)和(10)进入延伸循环步骤，分别形成(11)和(11)；内部引物又可以(11)和(11)作为模板，引导链置换DNA的合成，使产物的序列不断延伸、环化、再延伸，最终的产物是一些具有不同茎长度茎环结构的DNA和带有许多环的折叠结构的DNA的混合物。,.,10,LAMP法实验室常规操作步骤,.,11,.,12,.,13,.,14,优缺点,优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高25个数量级）；反应时间短（3060分钟就能完成反应）；临床使用不需要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浊度仪）；操作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、酶和模板混合于反应管中，置于水浴锅或恒温箱中63左右保温3060分钟，肉眼观察结果）。缺点：灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，故在进行试剂盒的研发过程中可采用实时浊度仪，不要把反应后的反应管打开；引物设计要求比较高，有些疾病的基因可能不适合使用环介导等温扩增方法。,.,15,.,16,.,17,应用,LAMP技术因其快速、高效、特异、灵敏和经济等优点，已经应用于病原菌、寄生虫、病毒、疾病和转
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