《基因工程PCR》PPT课件.ppt

第四节DNA聚合酶链式反应,PCR技术是一种模拟DNA体内复制过程的体外DNA复制过程，在一个离心管的缓冲液体系中，加入DNA模板，dNTPs,引物和DNA聚合酶，然后通过变性、退火、延伸三个温度的不断循环，使得目标DNA得到快速大量的复制。PCR技术已经广泛应用于科学研究和医疗事业，比如DNA的克隆，序列分析，医学诊断以及生物系统发生科学的研究等。,反应需要两条合成的寡核苷酸片段和耐热的DNA聚合酶。一般用TaqDNA聚合酶，是从栖热水生菌（Thermusaquaticus）中提取出来的。两条引物分别和正义链和反义链的3端结合，然后朝着彼此的3-OH方向延伸。,PolymeraseChainReaction（PCR）,PolymeraseChainReaction（PCR）,94,72,56,反应的第一步是加热DNA到95C进行变性（denature）使双链解离为单链，解除变性条件后在较低的温度50C下引物退火（annealed）结合到目标序列上，然后在72C下，在dNTPs存在的情况下，DNA聚合酶运用使引物序列延伸（extends）。热稳定的酶不仅可以使DNA快速合成,而且在较宽的温度范围内都能催化DNA合成。,三个步骤：变性,退火和延伸PCR循环:一般25-40个循环.每个循环都使目标序列翻倍从而PCR可以快速扩增,PolymeraseChainReaction（PCR）,PCR扩增过程中片段增殖的计算,随着扩增循环数的增加，长链目标片段增加的值为2(n+1),而短链目标片段则以几何倍数增加值为2(n+1)2(n+1)。20个循环后,目标片段大约增加1百万倍。,PCR使用的引物需特异性与目标序列匹配，如果引物与DNA分子的其他部位结合,非特异扩增将产生。引物与目标序列的特异性结合取决于温度,每对引物最适的温度要通过实验获得。寡核苷酸引物的长度一般为20-25个碱基，GC含量一般为50%左右，这样退火温度在52-58C之间。很长的寡核苷酸引物或高的GC含量需要很高的温度，而短的寡核苷酸引物或低的GC含量则需要较低的温度。对于17-25个碱基的引物,Tm的计算为:最适的退火温度一般比Tm低3-5C。,Primerdesignandcycleoptimization,1、所设计引物长度范围为18-27碱基，最长不超过38，因为过长会导致延伸温度大于74，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。2、引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则会容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发率增加。引物退火温度在50-70之间，上下引物之间退火温度相差不超过5。3、GC含量在40-60%之间，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。4、3末端最好不是A，3末端为A的错配效率明显高于其它三个碱基。,引物设计原则,PCR反应体系的确立,20uL反应体系中各成分的母液浓度及加入量,PCR扩增程序举例,PCR反应的应用,广泛应用于科研和实际检测中，用于DNA研究、序列分析、基因表达测定、从cDNA库放大特定克隆、构建基因图、进化分析、生物证据分析、医学研究与临床检验、性别控制、转基因生物检测等。,PCR扩增结果分析举例,M1234567M,M,marker;1-2,PCRforCP4-EPSPSgene;3-4,PCRfor35SPromoter;5