生物制药产业化及膜分离技术-下游纯化解决方案专帖

生物制药产业化及膜分离技术，下游纯化解决方案专帖！想知道震动膜的工作原理，能否相告呢？发邮件到。谢谢了先！yangzhiming wrote:非常感谢您的回复,我现在是利用RP-HPLC制备,纯度只能达到90%,也使用过离子色谱,效果也不好.主要是和主峰保留时间非常接近的杂质难以分离,不知用什么预处理方法,请您指教.多谢!IEC-HPLC不是很好操作，条件控制比较难，相对来说，RP-HPLC会好些。样品的预处理，当然有很多。比如脱盐，根据你的量选择合适的方法超滤手段脱盐。比如去除大分子蛋白，你也可以选择超滤。要是浓度不够，可以用超滤浓缩。另外，RP-HPLC的梯度选择比较重要，在选择好柱子后，然后考虑合适的梯度去完成实验，到底什么样的梯度最好，需要你去优化。洗脱剂的选择也是很重要的，不同洗脱剂效果是不一样的。比如乙氰和甲醇是不一样的。初学者请问：我们用miliipore的板式膜包纯化蛋白，目的蛋白的分子量是11kd，选择的膜包的分子量是30kd，没有压力表，靠流速来控制压力，逐级PBS洗滤，在不同 时间分别取截留和透过液，进行SDS-PAGE电泳，结果发现大部分的目的蛋白还在截留中，透过了不到五分之一，而且透过液中的杂蛋白不少，分子量大于30kd的也有，超滤的效果很差。我们的样品上样前经过了0.22um的膜过滤。膜用的是新膜。后来，我们又换了50kd的膜包。发现结果和30kd的膜包差不多，大部分的目的蛋白被截留了，这是什么原因呀？难道是样品过0.22um的膜后进行超滤，膜包在很短的时间又被堵了吗？还有，我做过的另一个试验，处理的样品是培养的上清，我们离心收集上清后，过膜上样，用30kd的膜包的进行分离，得到的结果也不理想，收集的上清液进行SDS-PAGE电泳，条代模糊，感觉好像盐离子浓度很高，难道是把培养基的成分也截留了?希望楼主能帮帮忙！aeve wrote:初学者请问：我们用miliipore的板式膜包纯化蛋白，目的蛋白的分子量是11kd，选择的膜包的分子量是30kd，没有压力表，靠流速来控制压力，逐级PBS洗滤，在不同 时间分别取截留和透过液，进行SDS-PAGE电泳，结果发现大部分的目的蛋白还在截留中，透过了不到五分之一，而且透过液中的杂蛋白不少，分子量大于30kd的也有，超滤的效果很差。我们的样品上样前经过了0.22um的膜过滤。膜用的是新膜。后来，我们又换了50kd的膜包。发现结果和30kd的膜包差不多，大部分的目的蛋白被截留了，这是什么原因呀？难道是样品过0.22um的膜后进行超滤，膜包在很短的时间又被堵了吗？还有，我做过的另一个试验，处理的样品是培养的上清，我们离心收集上清后，过膜上样，用30kd的膜包的进行分离，得到的结果也不理想，收集的上清液进行SDS-PAGE电泳，条代模糊，感觉好像盐离子浓度很高，难道是把培养基的成分也截留了?希望楼主能帮帮忙！您提的问题很好。谢谢您的问题！正好就您的这个问题，我把膜包的选择原则说明一下，好供大家参考。一般地，在没有任何实验或者经验的基础上，选择膜包以36倍为经验值。举例：您的11K目标蛋白，如果选择与大分子蛋白分离的话，则选择3366K标示量的膜包，商品膜包为50K或者100K的比较好。根据您所描述，30K肯定是不合适的。但是50K则不应该这样。如果您的目的是脱盐，或者更换缓冲液的话，那么选择11K/36=23K，商品有3K和1K的。一般说来3K可以满足的话，就不选择1K，因为通量3K比1K大。再者，有极端的情况，就是目标蛋白是线性分子，那么这个时候选择的系数要大一些，比如选择6。另外PH值 影响蛋白存在状态。还有，提醒一下，如果A家产品实验效果不好的话，可以考虑B家，不同的厂商膜的透过曲线是不一样的，甚至差别很大的。需要您把具体的情况和比较专业的人员交流，共同解决。另外膜包的材质要考虑，有些材质对于蛋白的吸附是比较厉害的，不适合蛋白的应用。正确操作下，膜不应该那么容易堵塞，即便堵塞，2种膜的动力学过程也不是一样的。还有，上游的盐浓度不应该很高，或者您超滤的时间短导致，或者操作有问题。您是怎么判断盐浓度的高低？用超滤膜脱盐得到样品液上离子交换柱，或者SDS-PAGE是超滤经常的应用之一。细节问题，可和我进一步交流。PM或者电话给我。祝成功！非常感谢楼主这么快时间内就回复了！我们用milipore的膜包不行的情况下，重新选择了另一家外国公司的产品，这次我们定的是20ml的超滤离心管（30kd）。SDS-PAGE的电泳结果提示超滤的效果非常不错：大部分的目标蛋白被透过了，杂蛋白的量也不是很多。我们从一开始就选择的是低蛋白吸附性的膜，milipproe定的是再生纤维素的，离心管定的是聚醚砜的，两家公司都说是低蛋白吸附性的。想和你进一步的请教。我的邮箱是DUWXIN126.COM请发email告诉我你的电话联系方式！aeve wrote:非常感谢楼主这么快时间内就回复了！我们用milipore的膜包不行的情况下，重新选择了另一家外国公司的产品，这次我们定的是20ml的超滤离心管（30kd）。SDS-PAGE的电泳结果提示超滤的效果非常不错：大部分的目标蛋白被透过了，杂蛋白的量也不是很多。我们从一开始就选择的是低蛋白吸附性的膜，milipproe定的是再生纤维素的，离心管定的是聚醚砜的，两家公司都说是低蛋白吸附性的。想和你进一步的请教。我的邮箱是DUWXIN126.COM请发email告诉我你的电话联系方式！首先恭喜你成功完成实验！一般地，再生纤维素的膜可以做到很小乃至1K，3K的商品化膜，但是蛋白吸附比其他滤材肯定要高。离心管可以定性地看结果，但是真正模拟生产的话，还是需要用平板膜去摸索条件，包括TMP，Flux，膜的清洗等。当然，你做的仅仅是R&D的话，则不需要考虑放大的事情。我比较忙,但是还是很乐意和大家在这里交流相关的技术问题。没有即使回复的话，请不要着急，也可以发邮件给我：888多谢老师回复,我也一直在摸索实验条件,只是经验太少事倍功半.我们做的是一种多肽,我负责纯化这块,用的4*30cm的 C18柱可以纯化样品,但是制备量太小,成本也比较高,如果上生产的话是不能满足产量的.所以不能满足现状,要探索能够满足生产,每次制备量达到克级的制备方法或制备柱.不知老师有何指教?yangzhiming wrote:多谢老师回复,我也一直在摸索实验条件,只是经验太少事倍功半.我们做的是一种多肽,我负责纯化这块,用的4*30cm的 C18柱可以纯化样品,但是制备量太小,成本也比较高,如果上生产的话是不能满足产量的.所以不能满足现状,要探索能够满足生产,每次制备量达到克级的制备方法或制备柱.不知老师有何指教?这个柱子（40*300mm？）也不小。对于您的多肽，最大载量多少？如果载量可以容纳的话，您尽量多上样，足够的载量之后，再行洗脱，得到尽量多的产品。在上样的时候，您选择的条件要尽量使得小肽容易吸附，也就是：创造合适的条件，满足多肽与填料的结合动力学常数较大的条件。比如介电常数，温度，PH值等。具体需要您去摸索。还有，上样时候，流速不能太快。或者反复循环上样。如何从鲜酵母中提取、纯化辅酶A、辅酶1、谷光甘肽、ATP、核苷酸？在这里先谢谢各位前辈、大虾！昆仑雪莲 wrote:如何从鲜酵母中提取、纯化辅酶A、辅酶1、谷光甘肽、ATP、核苷酸？在这里先谢谢各位前辈、大虾！除了核苷酸之外，全部是小分子成分。首先澄清，获得上清液。然后依据小分子各自的特性，去进行分离。比如核酸，您要确认是DNA还是RNA，再依据特性进行沉淀或者分离。先进行实验计划设计，然后根据需要制定方案。具体的，还需要您自己给出，我只能说这些。请教楼主PES和PVDF膜对蛋白的吸附有什么差异？差异有多大？rogerdq wrote:请教楼主PES和PVDF膜对蛋白的吸附有什么差异？差异有多大？不可以一概而论。1，PES既有亲水性，也有疏水性。所以用它的时候，需要足够的时间湿润，甚至在最完整性测试的时候，为了结果的准确，要求足够的湿润时间。2，PVDF天然为疏水性，所以在PTFE还不能广泛应用的时候，空气过滤器基本上就是天然的PVDF材质。现在仍旧广泛使用。3，因为PVDF有其独特的优点，比如耐受性强，耐高温，所以在经过长时间的研发之后，终于发现PVDF可以经过改性，达到亲水性的性能，于是诞生了过滤水星溶剂的PVDF过滤器，它具有较强的高温灭菌寿命。4，由于改性的工艺不同，有不同的产品问世，有的是全面的改性，有的只能在表面改性。主要因为生产膜的厂家不同，技术不一样，产品也不一样。自己生产的膜，在获得合适的工艺后，可以考虑自己全面改性；而在市面上购买别的厂家生产的滤膜进行改性时候，只能进行表面改性。5，蛋白的低吸附一直是该行业大家追求的目标，那么工艺的不一样，导致产品的性能差异，即蛋白吸附的高低。基本上好的厂家以上2者都可以做到满足低蛋白吸附的要求，不同的厂家的滤膜不见得有可比性。目前市面上有做得很好的低蛋白吸附PVDF膜，是经过全面改性的产品，您可以考虑。6，那么你依据怎么判断蛋白吸附高低呢？很简单，不管是谁向您推荐，您要求供应商给您提供官方认可的验证文件，以证明其低蛋白吸附性。这样就不会受骗。愿您找到合适的产品满足您的要求。各位前辈:你们好!我是新手.我上大四了,正在做毕业论文,课题是,由于没有师兄.师姐带,时间短.我的能力又有陷,怕做不好这个实验,以至毕不了业.我搞了个方案出来. 你能帮我看看吗?先谢了! 精子膜蛋白提取方法的对比研究 2006.doc (44.0k)各位前辈:你们好!我是新手.我上大四了,正在做毕业论文,课题是,由于没有师兄.师姐带,时间短.我的能力又有陷,怕做不好这个实验,以至毕不了业.我搞了个方案出来. 你能帮我看看吗?先谢了! 精子膜蛋白提取方法的对比研究 2006.doc (44.0k)goldsatr wrote:各位前辈:你们好!我是新手.我上大四了,正在做毕业论文,课题是,由于没有师兄.师姐带,时间短.我的能力又有陷,怕做不好这个实验,以至毕不了业.我搞了个方案出来. 你能帮我看看吗?先谢了!如果全部是您自己设计出来的，那么我相信你已经有很好的能力了，不属于能力有限（可能不是有陷？）。有这样的设计，还有响应的方案，一切没有问题。本科的毕业设计本来不是要求很高的，相信自己的能力。在很短的时间里，我们不可能要求太高。有什么实际的问题，希望能够给你建议。祝成功！给大家介绍一个很不错的全自动层析系统，流量从101000ml/min，可以进行自动化分级分离，可以优化条件，良好的界面和卫生级设计可提供合适的制药研发和生产需求，也符合GMP需要。中试乃至小规模的生产都可以满足。有兴趣的话，您可以和我联系，我可以帮助您满足您的要求。任何柱子均可以使用，甚至包括Mustang Q， Mustang S， E。 USD2356 - PKL Systems brochure.pdf (257.96k)你好，我的产品分子量为5000，想找一种合适的膜和设备，去掉分子量小于5000的杂质。设备的处理量要小些，不能超过2 L。我知道超滤杯可能行，但需要氮气，比较麻烦，有没有其他的设备，麻烦你了：）我可以推荐一个有意的话可以PM我。实验处理量小于800ML，就可以了！以上2位，我在外出差，尽快答复你们。抱歉晚复。求教，我们哺乳动物细胞培养收获液需要澄清过滤，我们希望用深层过滤器预过滤，虽然供应商的说明上可以10次蒸汽灭菌，但是不知道深层过滤器是否可以清洗干净，如果用一次就仍也太浪费了吧。另外“即开即用”型（塑料外壳，拆开直接蒸汽灭菌）的可蒸汽灭菌的滤器说明书上可3次蒸汽灭菌，但是同样有一个清洗的问题，是不是用一次就仍啊？谢谢各位前辈！云淡风清nj wrote:你好，我的产品分子量为5000，想找一种合适的膜和设备，去掉分子量小于5000的杂质。设备的处理量要小些，不能超过2 L。我知道超滤杯可能行，但需要氮气，比较麻烦，有没有其他的设备，麻烦你了：）/quoto您需要一个小型超滤器。最小工作体积大约100ml，大可以到几千ml。要是考虑减小损失的话，最好选择1K的膜包，如果不特别在意主要成分的损失，可以选择3K的膜包。系统配置及技术规格:1 ，膜包夹持器:316L不锈钢材质, 内外表面镜面抛光20RA（美制），进、出、回流液接口均为1/2卫生级卡箍连接。2， 膜包: 低蛋白吸附, 高通量, 有效膜面积1ft2/块, 应可提供完整的验证报告。可提供FDA认可的VALIDATION文本，超滤膜包在使用中采取平板膜叠加方式，所有流道均为并联，从而保证了每块膜的切向流和过滤压力相同。在减少产品残留的同时，更便于超滤膜包的清洗及反复使用。3，蠕动泵：符合制药级标准的MASTERFLEX蠕动泵，电压：220V-240V，50Hz，配有15#制药级硅胶管，转速6-600rpm, 连续可调。4，阀门：Alfa Laval或其它厂家同等质量隔膜阀。材质：316L不锈钢支架：304不锈钢制造，上述超滤系统的各个组件均被装置在此支架上，支架表面均经打磨抛光。支架占地尺寸约为：400mmx300mm5，胶管: ID4，8mm。6，压力表：Ashcroft 或其它厂家同等质量隔膜压力表。7，系统配套附件：Ashcroft制药级316L不锈钢隔膜压力表2只（分别安装在进口和回流口）Saunders制药级316L不锈钢隔膜阀2个（分别安装在回流和透过液管线上）接口管件均为316L不锈钢材质，内外表面镜面抛光，管道连接均为1/2”卫生卡箍。以上系统可以进行很多的实验，比如浓缩，脱盐，缓冲液更换，蛋白质的分级分离。稍微小的系统也可以满足您的需求，但是要特别注意，用很小切割分子量的膜，本身Flux速度很慢，处理量要求不能用太小面积的膜。用超滤杯，我个人认为不是合适选择。warmice1 wrote:求教，我们哺乳动物细胞培养收获液需要澄清过滤，我们希望用深层过滤器预过滤，虽然供应商的说明上可以10次蒸汽灭菌，但是不知道深层过滤器是否可以清洗干净，如果用一次就仍也太浪费了吧。另外“即开即用”型（塑料外壳，拆开直接蒸汽灭菌）的可蒸汽灭菌的滤器说明书上可3次蒸汽灭菌，但是同样有一个清洗的问题，是不是用一次就仍啊？谢谢各位前辈！谢谢您的好问题！在国外，一般深层滤器是一次性使用，但是他们的批处理量很大，所以使用得总量也是相当大，基本上不需再处理使用。一次性就是避免清洗及其随后的清洁验证问题，因为验证的花费要比滤器本身的花费更大。在国内，本着节约的原则，很少购买一次性的产品。对于深层滤器而言，清洗问题不大，能够耐收多大程度的灭菌循环，你需要供应商提供相应的文件。还有一点比较重要。深层滤器的湿强度，可能是非常重要的因素，第二次就没有强度了，其他就没有意义。对于即开即用的滤器，一般是经过消毒了的产品。基本上是一次性使用。你所说的不属于“即开即用”滤器，因为还没有消毒，它也可以清洗干净，但是我前面说过，是否清洗干净，需要你验证。真正验证的费用，可能不会少，甚至比买新的价格更高。谢谢您的回答!我们打算多次使用深层滤器,但它是纤维结构,怎样才能清洗干净啊?过滤后应该有很多细胞和碎片吧.另外即开即用的塑料外壳的滤器也要灭菌的,如果想清洗一般如何洗才好?万分感谢!warmice1 wrote:谢谢您的回答!我们打算多次使用深层滤器,但它是纤维结构,怎样才能清洗干净啊?过滤后应该有很多细胞和碎片吧.另外即开即用的塑料外壳的滤器也要灭菌的,如果想清洗一般如何洗才好?万分感谢!如果您一定要清洗再用，那么我给点意见。1，您的滤器是哪个厂家？是以什么形式存在？比如板式（Sheet），圆盘式（Disc）？不同的厂家湿强度不一样，据我所知，能够反复使用切湿强度好的供应商可能全球仅有那么一家。如果湿强度大雨200可以反复用；小于200则难以反复使用，因为变形的缘故。2，深层滤器的材质是复杂的，是多种材质的复合，比如硅藻土，纤维等，不同厂家的成分也不一样，所以你需要弄清楚，而该产品到底能否反复使用及使用程度，如何清洗，您最好让供应商提供您技术文件，而不是靠“嘴”来说。3，简单的清洗方法是先用碱液清洗，然后用水清洗。不过您最好还是先弄清楚到底该产品是否适合？我再次强调：不同厂家产品不一样。4，您所说的“即开即用”可能是囊式滤器。即开即用是不需要灭菌的就可以直接使用的，因为已经Co60照射灭菌。如果开了之后还要灭菌，那怎么能叫“即用”除菌过滤？5，在做过滤之前，您需要和供应商讨论，根据您的使用目的，过滤量等条件，选择合适的规格及产品做您的实验，这样有很多好处。那种随意的推荐和没有技术考虑的建议是不负责任的。6，对于这样产品的清洗，您还是需要和供应商交流，了解起特点选择清洗的方法。如果耐受碱性强的话，您可以考虑碱液清洗后水洗。碱液的浓度大约0，10，5M。7，再次建议，您在选择滤器前需要多考虑待处理料液的情况。万分感谢您的建议!我们打算用 Millipore的,希望能反复使用.请问震动膜，陶瓷膜和扩张床似乎都可以澄清料液，我想知道他们的优缺点，在什么情况下选则合适，迷惑中。谢谢各位高手了swordhearter wrote:请问震动膜，陶瓷膜和扩张床似乎都可以澄清料液，我想知道他们的优缺点，在什么情况下选则合适，迷惑中。谢谢各位高手了最大的缺点是：所有产品造价都不低；1，寿命长，震动膜，陶瓷膜都不需要再生。前者12年，后者35年。比较保守的数据。2，经过清洗后不留污染，易于验证。3，处理量可以很大，对于陶瓷膜可以无限制的大。4，再者，固形物含量可以很高，处理黏度很大的料液，是很棒的。陶瓷膜有50%固形物仍旧可以运行。5，扩张床我不是专家，不是很了解，但是把它单纯用作澄清料液，是不是有些可惜了？请教高处胜寒老师, 我的细胞培养上清需要进行超滤浓缩, 超滤柱是PS膜组件,想请问老师,这种膜材料容易吸附蛋白吗?一般浓缩多少倍比较合适呀,我上次浓缩了20倍,即10L上清变成500ml,发现有相当的蛋白沉淀,有没有什么方法可以解决问题呀?谢谢老师wengpin wrote:请教高处胜寒老师, 我的细胞培养上清需要进行超滤浓缩, 超滤柱是PS膜组件,想请问老师,这种膜材料容易吸附蛋白吗?一般浓缩多少倍比较合适呀,我上次浓缩了20倍,即10L上清变成500ml,发现有相当的蛋白沉淀,有没有什么方法可以解决问题呀?谢谢老师1，澄清-超滤浓缩是细胞培养液的常规处理工艺。2，澄清根据不同的产品及量有不同的选择方式，比如微滤，切向流微滤等。需要考虑蛋白吸附问题。尽量选择蛋白损失小的工艺。3，超滤浓缩得到合适的浓度。在这里，正如题主所言，工艺是很重要的，您不能浓缩到蛋白已经沉淀时候才停止。那么到底什么浓度是合适的浓度？各种产品工艺不一样，一般在未知产品性