免疫细胞分离与免疫细胞功能检测及应用

第十三章免疫细胞分离与免疫细胞功能检测及应用,河南科技大学第一附属医院检验科许德英,第十三章免疫细胞的分离与免疫细胞功能检测及应用,第一节免疫细胞的分离一、外周血单个核细胞分离二、淋巴细胞的分离三、T细胞和B细胞的分离四、T细胞亚群的分离,第二节淋巴细胞标志及亚群分类一、细胞表面标志及亚群二、B细胞表面标志三、NK细胞表面标志第三节抗原提成细胞表面标志的检测一、单核-吞噬细胞系统二、树突状细胞第四节淋巴细胞的功能检测一、T细胞功能检测二、B细胞功能检测,三、NK细胞活性测定第五节其他免疫细胞功能检测技术一、中性粒细胞功能检测二、巨噬细胞功能检测第六节免疫细胞表面标志和功能检测的临床应用,思考题小结,第一节免疫细胞的分离,外周血单个核细胞分离淋巴细胞的分离T细胞和B细胞的分离T细胞亚群的分离,一、外周血单个核细胞分离,外周血单个核细胞（peripheralmononuclearcells,PMNC）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。,细胞分离基本原理,不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同,不同细胞密度不同,人的红细胞密度为1.093粒细胞密度为1.092单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090,不同细胞密度不同,用1.0770.001的分层液可将细胞分离,分离液的基本要求,对细胞无毒,基本等渗,不溶于血浆或分离物质,有一定密度,密度梯度离心法（densitygradientcentrifudation),Ficoll（商品名）成份：2份6%聚蔗糖（ficoll)水溶液+1份34%泛影葡胺（hypaque)生理盐水溶液。最常用的方法，分离纯度可达95%，细胞获取率80%。试验尽量在低温下进行（48或冰浴）。,密度梯度离心(Ficoll)离心,密度梯度分离单个核细胞（Ficoll分层液）,密度梯度分离单个核细胞（Ficoll分层液）,二、淋巴细胞分离,贴壁粘附法吸附柱过滤法磁铁吸引法Percoll分离液法（连续密度梯度离心）,（去单核细胞）,贴壁黏附法将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37温箱静置1h左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。因B细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。,2.吸附柱过滤法将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。此法简单易行，对细胞极少损害。,3.Percoll分层液法,Percoll(商品名）经过聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrolidone,PVP)处理的硅胶颗粒大小不一的混悬液。高速离心后，形成连续密度梯度，可将密度不同的细胞分离纯化。分离淋巴细胞纯度达98%，单个核细胞纯度达78%。流程长、烦琐、费用高。,密度梯度分离单个核细胞（Percoll分层液）,E花环沉降法尼龙毛柱分离法,三、T细胞和B细胞的分离,E花环分离法,T细胞（CD2/LFA2/E受体）,绵羊红细胞SRBC,E花环,比重增加,Ficoll-Hypaque分离液分离,低渗,尼龙棉柱分离法,尼龙棉装入5ml注射器中,加入淋巴细胞悬液,37、5CO2、12h,RPMI1640完全培养基灌洗,洗脱液中为T细胞,原理B细胞可粘附尼龙毛；T细胞不具有粘附活性。,方法评价：,实验室常用分离方法之一简便、易行获得细胞纯度较高T细胞90B细胞80尼龙毛柱法E花环法，T细胞可达99以上,四、T细胞亚群的分离,亲和板结合分离法磁性微球分离法荧光激活细胞分离仪分离法,亲和板分离法,利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群，其原理是各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取。同样若用特异性抗原交联在塑料板上，则可分离得具有特异抗原受体的淋巴细胞。淋巴细胞受体与特异抗原或抗体接触，可引起细胞激活，因此，凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时，本法更适用。如要分离CD4+或CD8+细胞，则可用抗CD4或CD8单克隆抗体吸附。用抗Ig抗体则可分离B细胞。同样，用活化的C3包被，可分离出有C3受体的细胞。,荧光激活细胞分离仪分离法,（五）免疫磁珠法,原理：将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠（Immunomagneticbead，IMB）,加入细胞悬液，IMB上的Ab与细胞表面的Ag反应，形成抗体/抗原的复合物。,外加磁场，分选出结合有免疫细胞的IMB。,直接法,磁珠大小可以选择,大小免疫磁珠分离细胞的特点比较,免疫磁珠法细胞分选过程,免疫磁珠细胞分选装置,全自动细胞分选系统,流式细胞分析仪,细胞分选,细胞分选（cellsorting）：有选择地从一个混合细胞群体中分离出某一类特定细胞的技术。,488nmlaser,-,FluorescenceActivatedCellSorting,ChargedPlates,Singlecellssortedintotesttubes,FALSSensor,Fluorescencedetector,第二节淋巴细胞标志及亚群分类,常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗原（Clusterofdifferentiation，CD）。,细胞表面分化抗原（CD抗原）,适用于T、B细胞的分离已知CD抗原细胞亚群的分离未知CD抗原细胞亚群的分离（阴性分选）,一、T细胞表面标志及其亚群,CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（helpTcell,Th）CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+调节性T细胞（regulatoryTcell,TrorTreg）,二、B细胞表面标志,SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。,三、NK细胞表面标志,人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。,T细胞及NK细胞,第三节抗原提成细胞表面标志的检测,抗原提呈类细胞表面标志,抗原递呈细胞（antigenpresentingcells，APCs）是一类能摄取、加工、处理抗原，并将抗原信息递呈给T细胞的重要免疫细胞。包括专职APC（professionalAPC）：单核巨噬细胞、树突状细胞（dendriticcell，DC）、B细胞非专职APC（non-professionalAPC）：内皮细胞、纤维母细胞、各种上皮和间质细胞,APC的概念,一、单核吞噬细胞系统,1924年，Aschoff提出了网状内皮系统（reticulo-endothelialsystem）)的概念，该概念将一些能吞噬活体染料的细胞，如血中的单核细胞、结缔组织中、肝脏及脾脏内的巨噬细胞、网状细胞和血窦壁的内皮细胞等，总称为网状内皮系统，并认为它们均源于网状细胞。现已证明血窦内皮细胞和网状细胞只有弱的吞噬能力，也不能转变为巨噬细胞，不应归入此系统。,因此，1972年世界卫生组织正式提出了单核吞噬细胞系统的概念（mononuelearphagocytesystem，MPS）。它指出：该系统是指分散在许多器官和组织中的一些形状不同、名称各异、但都来源于骨髓的单核细胞，且具有吞噬能力和活体染色反应的一类细胞。中性粒细胞虽有吞噬能力，但无活体染色反应，更非由单核细胞转变而来，故不属此系统。,一般认为单核吞噬细胞系统的成员有如下几种细胞：骨髓：多能干细胞单核母细胞前单核细胞骨髓和血液：单核细胞（血液）各种组织：组织细胞（结缔组织）枯否氏细胞（肝）尘细胞（肺）巨噬细胞（淋巴结、脾、骨髓）破骨细胞（骨组织）小胶质细胞（神经组织）郎格罕细胞（皮肤）,单核吞噬细胞系统功能：1、吞噬清除2、参与免疫应答3、分泌功能,二、树突状细胞（dendriticcells，DCs）,DC是形态上具有典型树突样、毛刺样突起，膜表面高表达MHC-II类分子、辅助刺激分子和黏附分子并能从非免疫组织移行至淋巴器官刺激初始T细胞活化增殖的一类异质性细胞群体。功能最强的抗原提呈细胞。,DC的来源和分布,DC分布全身各组织脏器（除脑组织外）。langgerhanscells（LC），分布于表皮、胃肠道上皮interstitialDC，分布于心、肝、肺、肾等脏器folliculardendriticDC（FDC），分布于淋巴结滤泡区interdigitatingcell（IDC），胸腺依赖区和胸腺髓质,树突状细胞,树突状细胞的形态1973年，Steinman和Cohn在小鼠脾脏发现具有树枝状突起的独特形态的细胞，将之命名为树突状细胞。小鼠骨髓DC光镜下呈树枝状，细胞核清晰可见。电镜下细胞表面有许多突起，凸凹不平；细胞核不规则，呈肾形、椭圆形或马蹄形，染色较深，常偏于一侧，核膜清晰可见。经免疫组织化学染色，可见细胞大而突起多，细胞内充满弥散或细颗粒状的棕黄色物质；细胞形态不规则，呈梭形、多边形或星形，细胞表面可见明显树枝状突起；核大而不规则。,树突状细胞的组织分布,间质性树突状细胞朗汉斯细胞（LC）,DC广泛分布于脑及睾丸以外的全身各脏器，数量极少。,据分布部位的不同,淋巴样组织中的DC,非淋巴样组织中的DC,体液中的DC,滤泡树突状细胞（FDC）并指状树突状细胞（IDC）边缘区树突状细胞,隐蔽细胞血液树突状细胞,滤泡树突状细胞FDC,存在于几乎所有的次级淋巴组织，包括脾脏、淋巴结、扁桃体和肠道的Peyers结节，位于B细胞区（淋巴结浅皮质滤泡内生发中心或脾白髓淋巴小结）能有效地捕捉复合物形式的抗原，将抗原长期保留在细胞表面并能保持其免疫原性，避免其在体内降解并维持次级滤泡的记忆功能；FDC能将抗原结合到B细胞上，经B细胞加工处理后提呈给Th，启动再次免疫应答。,并指状树突状细胞IDC,IDC位于淋巴组织T细胞区细胞内缺乏大量的吞噬体和溶酶体；能表达MHC-类分子和MHC-类分子，不表达FcR及C3R。IDC能进入T细胞区发挥免疫刺激作用，启动免疫应答。,朗汉斯细胞LC,LC存在于皮肤、呼吸道上皮及消化道粘膜上皮细胞表面有MHC-类分子和MHC-类分子，胞浆内含有朗汉斯颗粒或称Birbeck颗粒（BG），在超微结构水平可看到杆状或球拍状的细胞器，(标志性鉴别结构)此细胞器含有LC特异性颗粒抗原，可采取单克隆抗体通过免疫组化或流式细胞仪鉴别。LC具有较强的摄取和加工处理抗原的功能，但其免疫刺激能力较弱。,心、肺、肝、肾等器官结缔组织中的DC,间质树突状细胞,DC亚群,髓系DC淋巴系DC细胞表型CD11CD123CD11CD123产生细胞因子IL-12IFN、IL-10诱导免疫应答类型Th1型免疫应答免疫耐受和Tr1形成,来源于髓系干细胞DC1，也称单核细胞样DC来源于淋巴系干细胞DC2，也称浆细胞样DC,CD123为IL-3R，两者都表达CD40,人成熟DC的主要特征表面标志为CD1a、CD11c和CD83，高表达特异性抗原、MHCI、II类分子、CD54、CD80、CD86、CD40等黏附分子和共刺激分子，同时能分泌IL-12。不表达单核吞噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞的典型的表面标志（CD14、CD3、CD19和CD20、CD16和CD56)。加工处理抗原能力弱，向T细胞提呈抗原能力强。,第四节免疫细胞表面标志的检测及应用,免疫细胞表面标志的检测方法淋巴细胞表面标志检测的临床意义,一、免疫细胞表面标志的检测,抗体致敏细胞花环法免疫细胞化学法免疫荧光法流式细胞分析法,二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义,淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。对CD4+和CD8+T细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。,临床常见疾病中的T淋巴细胞的变化,小结,淋巴细胞并不是功能单一的群体，但其在光学显微镜下的形态基本是一样的，因此要对其进行进一步的分类和观察就不能采用形态学的方法，而要依靠对其表面标志的检测。常用于鉴定和检测计数淋巴细胞的表面标志是CD抗原。,进一步区分淋巴细胞亚群可使某一类淋巴细胞的功能趋向一致和单一。但目前看来，还很少有只通过一个CD抗原就能将某一类淋巴细胞亚群指示出来的CD抗原，CD抗原指示出来的淋巴细胞亚群多数都是相对特异。,根据T细胞的免疫效应功能和表面CD分子表达至少可以分为：辅助性T细胞、细胞毒性T细胞和调节性T细胞；SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标，以CD5和CD19为标志可将B细胞分为B1和B2两个亚群；目前多以CD3-、CD16+、CD56+作为NK细胞的典型标志。,对淋巴细胞群，中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞等功能测定可以有效评价机体特异性和非特异性免疫功能。,第一节淋巴细胞的功能检测,淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定,淋巴细胞,T细胞（负责细胞免疫功能）B细胞（执行体液免疫功能）NK和K细胞（非特异性免疫作用）,一、T细胞功能的检测,T细胞增殖试验T细胞分泌功能测定T细胞介导的细胞毒试验体内试验,（一）T淋巴细胞增殖试验,1.原理：,淋巴细胞,DNA合成,分化,母细胞,刺激物,细胞变大,细胞浆扩大,空泡,核仁明显,核染色质疏松,2.淋巴细胞转化的刺激物,非特异性刺激物：PHA-T细胞ConA-T细胞PWM-T、B细胞LPS-B细胞特异性刺激物：异种抗原同种组织抗原,淋巴细胞,DNA合成,分化,母细胞,刺激物,细胞变大细胞浆扩大空泡核仁明显核染色质疏松,T淋巴细胞增殖试验,3.检测方法,形态法：刺激物淋巴细胞（4-6天）母细胞化同位素法：PHA淋巴细胞（54h）DNA合成期+3HTdR掺入收集细胞检测射线,测定细胞内的3HTdR,（1）形态学检查法,方法学评价：,优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。,原理：,刺激物,3756h,G1期S1期,合成DNA,3H-TdR,3716h,DNA-3H-TdR,测淋巴细胞内放射量（cpm）,计算SI,判断淋巴细胞转化程度,外周血（T）G0期,3H-TdR掺入法,（2）3H-TdR掺入法,优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。,原理：,外周血T细胞,PHA,发生增殖,MTT,含蓝色甲颗粒的T细胞,MTT,PHA,有机溶剂,测吸光度（A）值,计算SI判定细胞增殖结果,SI=,(SI2具有意义),MTT比色法,(二)T细胞分泌功能测定,体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映T细胞功能。,（三）T细胞介导的细胞毒试验,1.原理：,靶细胞抗原,T细胞,观察杀伤活力,致敏CTL,靶细胞,形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞计数残留肿瘤细胞同位素法：淋巴细胞（CTL）+含51Cr的肿瘤细胞肿瘤细胞破坏51Cr释放测定射线,2.方法,意义：肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力,(四)体内试验,特异性抗原皮肤试验PHA皮肤试验,二、B细胞功能检测,B细胞增殖能力的试验溶血空斑试验B细胞抗体形成功能的检测体内试验,(一)B细胞增殖能力的试验,抗IgM细菌脂多糖SAC的SPA,B细胞增殖,形态学,3HTdR掺入法,(二)溶血空斑试验,1.原理：,2.方法学：,经典溶血空斑形成试验被动溶血空斑试验,3临床应用与评价,溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。,(三)B细胞抗体形成功能的检测酶联免疫斑点法,1.原理：,2应用与方法学评价：,该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。优点：稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。,(四)体内试验,体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞的功能。,染色计数,离心取上清测LDH或AKP,离心取沉淀测活细胞荧光,测发光强度,测CPM值,形态法酶释法荧光法同位素法化学发光法,三、NK细胞活性测定,靶细胞溶解,常用靶细胞:K562细胞株,第二节吞噬细胞功能检测技术,吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。一、中性粒细胞功能检测技术二、巨噬细胞功能检测技术,吞噬细胞的功能：,趋化吞噬胞内杀灭作用,一、中性粒细胞功能的检测,细胞趋化功能的检测吞噬和杀菌功能的检测,(一)细胞运动功能趋化功能检测,1.原理：,2.方法学：,琼脂糖平板法,滤膜渗透法（Boyden小室法）,中性粒细胞趋化功能检测琼脂糖平板法,中性粒细胞趋化功能检测Boden小室法,BoydenChamber,Shietal.JImmunolMethods,1993,164:149,中性粒细胞吞噬功能测定,中性粒细胞