IBV分子进展（课堂PPT）

鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的分子生物学研究进展,1,2,IB简介,鸡传染性支气管炎（AvianInfectiousBronchitis，IB）是鸡的一种急性、高度接触性传染病，本病的易感动物主要是鸡，亦见于鸽等动物，鸡6周龄以内发病率高达90，死亡率在2540。主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统。本病最早由美国Schalk和Hawn报道，临床以患鸡咳嗽、喷嚏和气管啰音的呼吸道症状为主，之后陆续在各国发生，呈世界性分布。能使成鸡的增重和饲料报酬降低，鸡蛋产量、质量和孵化率下降，并直接导致雏鸡死亡、肾脏病变和输卵管永久性退化。近年来，该病的流行呈上升趋势，尤其肾型IB（主要引起肾脏肿大、尿酸盐沉积）已蔓延至全国各养鸡地区，造成了严重经济损失。,2,2020/5/19,IB简介,IBV的血清型较多，常见的有Massachusetts、Connecticat、lowa97、lowa609、Hotle、JMK、Clark333、SE17、Florida、Arkanass99和Australian“T”等。IBV基因组核酸RNA复制的不连续机制及RNA聚合酶的不完全校对机制，使得病毒RNA在复制过程中易发生基因点突变、插入、缺失或重组，造成大量IBV变异株的出现，目前世界上已分离到的IB血清型已达30种之多，不同血清型毒株疫苗之间仅有部分或无交叉保护作用，IB的多血清型性为其免疫预防增加了难度。,3,2020/5/19,从以下几方面介绍IBV的研究进展：1、基因组结构2、主要结构蛋白及生物学功能3、复制过程4、变异机制5、鉴定和检测,4,2020/5/19,1、IBV的基因组结构,IBV属于冠状病毒科，是冠状病毒的代表株。其为正链单股RNA病毒，直径90200nm，是所有RNA病毒中最大的。病毒有囊膜，表面有放射状排列的杆状纤突。IBV是第一个测定了基因组全部序列的冠状病毒，共有27608个核苷酸组成，长2730kb，5端有帽子结构，3端有poly（A）尾，至少有10个明显的ORF，编码分子量6.7440K的蛋白，现已确定的ORF的定位次序如下：5Cap1a-1bS3a3b3c（E）-M5a5bN-Poly（A）-3，分别编码病毒的结构蛋白和非结构蛋白。IBV被分为6个区域，由小到大分别被命名为mRNAAF。,5,2020/5/19,2、IBV的主要结构蛋白及生物学功能,IBV含三种最主要的结构蛋白：纤突蛋白（SpikeGlycoprotein，SGP，即S蛋白）、膜蛋白（MembraneGlycoprotein，MGP，即M蛋白）、核衣壳蛋白（NucleocapsidProtein，NP，即N蛋白），分别由mRNAE、C、A编码，三种结构蛋白的摩尔比为1：6：15，第四种小膜蛋白（sM）与病毒囊膜有关。病毒的血清型、血凝抑制和大多数的中和抗体均由S1蛋白决定和诱导。,6,2020/5/19,2.1纤突蛋白（S）,S蛋白由mRNAB编码，位于病毒粒子最表层的囊膜上，是构成病毒纤突的主要成分。S蛋白包含两种糖多肽S1和S2，具有非常重要的生物学功能：S蛋白与宿主细胞膜上糖蛋白受体的结合，使IBV吸附在宿主细胞上，只有S蛋白被宿主细胞的蛋白酶切割为S1和S2两条糖多肽时，病毒囊膜才有融细胞膜的活性；可诱导血凝抑制抗体和中和抗体（VN）；S1蛋白的氨基N端决定IBV毒株的组织亲和性及其毒力；S1蛋白是决定IBV血清特异性抗原决定簇的主要蛋白；S2蛋白可诱发较弱的中和抗体有免疫优势，并在大多数IBV毒株保守，可作为IBV疫苗。,7,2020/5/19,2.2膜蛋白（M）,M蛋白是一种跨膜蛋白，它是IBV粒子中含量最多的糖蛋白，M蛋白由mRNAD所编码，其N端位于病毒粒子外部并被糖基化。M蛋白具有控制并介导病毒粒子从粗面内质网膜活高尔基体膜出牙，在病毒装配时与核衣壳相互作用，并将核衣壳结合到囊膜上的作用。研究发现，与核衣壳蛋白和纤突蛋白相比，M蛋白的免疫原性最低。然而，也有报道认为M蛋白上存在着重要免疫原性的抗原决定簇，但其免疫学功能还需要进一步研究。,8,2020/5/19,2.3核衣壳蛋白（N）,核衣壳蛋白是唯一位于病毒内部的结构蛋白，位于囊膜内与基因组RNA紧密结合的核衣壳上，分子量为46kDa，占病毒蛋白总来那个的40%，在整个基因组的进化过程中相对最为保守。N蛋白在病毒复制、组装中有重要作用。N蛋白与先导RNA序列相互作用有助于病毒mRNA合成和病毒RNA结合形成螺旋状衣壳结构，使之容易装入病毒壳内。N蛋白还是免疫识别相关靶位，在细胞免疫和体液免疫中起重要作用。,9,2020/5/19,3、IBV的复制过程,IBV的复制主要在感染细胞的胞浆内完成，毒粒通过囊膜上的S糖蛋白与靶细胞膜上的特异受体结合，并吸附在细胞表面，以细胞膜与病毒囊膜融合或内吞的方式进入细胞。,10,2020/5/19,3.1IBV基因组的复制,病毒基因组一旦进入细胞，便在胞浆内完成其生物学过程。作为一种正链RNA病毒，IBV进入胞浆后首先是让病毒基因组RNA与细胞核糖体结合，从5端翻译病毒特异的早期依赖于RNA的RNA聚合酶。mRNA的复制不需要细胞核的功能，而是按照特殊的先导-引物转录模式，该RNA聚合酶使病毒的正链基因组RNA转录出一条全长的互补负链RNA，其5端有一段Poly（U）序列。然后以负链RNA为模板，通过另外一种依赖RNA的RNA聚合酶进一步转录出新的正链基因组RNA（mRNAF）和一套5个亚基因组mRNA（mRNAEA）。,11,2020/5/19,3.1IBV基因组的复制,先导-引物转录模式（leader-primeredtranscription）：先导RNA（即先导序列）从负链RNA3端转录出来后与模板链（即负链RNA）分离，但继续与RNA聚合酶保持联系。该先导物-聚合酶复合物继续向模板链下游移动，当遇到与先导RNA互补的序列时，以此为识别信号，重新结合模板链，并以先导RNA作为引物，转录出一条亚基因组mRNA。经过上述不同mRNA起始位点的结合，结果得到一套长度递减的mRNA。,12,2020/5/19,3.1IBV基因组的复制,mRNAE、C、A在5端特殊区（即比其小的mRNA中所不存在的序列）中各自含有单一的ORF，因此是功能性单顺反子，分别编码S蛋白、M蛋白和N蛋白。而mRNAF、D、B的5端特殊区均含有一个以上的ORF，说明它们是功能性多顺反子。mRNAF为新的正链基因组RNA，它与原基因组RNA等长，是以负链RNA为模板拷贝下来的，其合成从负链RNA3端开始，但启动子或先导RNA的延长却是从负链RNA上内部特异性位点开始的，涉及mRNAF合成的依赖RNA的RNA聚合酶与合成负链RNA的RNA聚合酶不同，主要表现在前者需要先导RNA作为引物。,13,2020/5/19,3.2结构蛋白的合成,在结构蛋白中，N蛋白在细胞质的核糖体上合成，经磷酸化后与新合成的基因组RNA相互形成螺旋状的核衣壳。M蛋白的合成发生在粗面内质网膜结合的多核糖体上，糖基化过程则需要等多肽运转到高尔基体后才能进行。S蛋白氨基端带有信号序列，所以多肽合成后，马上就插入粗面内质网膜，S蛋白单体在粗面内质网膜上装配成多聚体纤突后，在高尔基体中参与毒粒的合成。过剩的S则被转运并插入到宿主细胞膜。,14,2020/5/19,3.3毒粒的组装及释放,病毒结构蛋白在细胞内的积聚是病毒粒子装配的先决条件，可能是通过发出信号使病毒RNA的合成由mRNA转向基因组RNA。病毒颗粒的组装起始于基因组RNA和结构蛋白，如N蛋白相互作用形成核衣壳，随后启动病毒蛋白质-蛋白质、蛋白质-RNA相互作用的一系列反应。病毒核衣壳在内质网上出芽，并在此过程中获得双层质膜和S蛋白，成熟的病毒粒子被转运到高尔基体并经过修饰后，被包入囊泡中释放出胞浆。毒粒从细胞释放的机制可能有两种方式：一是从裂解的感染细胞中直接释放；二是含毒粒的囊泡被转运到细胞边缘，然后通过分泌或溶细胞膜作用从细胞中释放出来，不会造成宿主细胞的裂解。,15,2020/5/19,4IBV的变异机制,与所有冠状病毒一样，IBV的核酸具有很高的基因突变及RNA-RNA重组率，这就是IBV不断有新的血清型和变异毒株出现的主要原因。而IBV基因容易发生变异的原因主要有以下几点：首先，RNA容易降解，不稳定；其次，缺乏作为单链RNA的互补链，IBV的RNA聚合酶缺乏校对机制，使得每一轮复制过程中都有可能诱发变异；再次，IBV是按照特殊的先导引物转录机制进行RNA合成的，RNA聚合酶必须沿模板“跳跃”前进，并且合成的是一组不连续的但某些区域又很相似的mRNA，这就造成RNA聚合酶有可能不完全沿着一条模板移动，其结果必然导致高频突变或重组的发生。,16,2020/5/19,4.1基因突变,IBV的S蛋白、N蛋白、M蛋白在病毒的进化上3表现出变异现象，其中又以S蛋白的变异最为明显。有研究表明，S蛋白的50170位和250310位的氨基酸残基发生替代的概率较大，而120170位氨基酸残基更常见插入或缺失。Bing等人对我国不同省的5株不同IBV的S1蛋白进行了基因和进化分析的研究，发现5株IBV的核苷酸和氨基酸的同源性分别是76.7%92.1%和73.9%89.5%，这表明不同分离株的S1基因有很大变异。他们认为S1蛋白基因的点突变、插入和删除在很多地方都能见到，尤其是在S1蛋白N-末端的前150个氨基酸。一般认为冠状病毒的N蛋白是高度保守的，同一病毒的不同毒株间的同源性达90%以上。,17,2020/5/19,4.2基因重组,自然状态下发生的野毒株之间以及疫苗之间的基因重组，是引起IBV不断产生新的血清型的重要原因，这种遗传信息的改变可能是冠状病毒在自然界中生存的一个重要机制。Bochkov等用RT-PCR的方法扩增了10种IBV并对它们进行了测序。基于S1基因序列的进化分析显示有5株病毒属于793/B毒株，他们在组内拥有91.3%98.5%的核苷酸相似性；有1株和624/I毒株有96.4%的同源性；另外2株以前在意大利已被检测出；其他3个变异株形成一个新的基因亚型。相反，基于更为保守的N基因序列的进化分析显示不同饿分群。因此，彼此在S1基因序列有96.7%99.2%相似性的Italy-02亚型的3个变异株，在N基因序列上属于3个不同的亚型。他们的结果证明，基因重组和突变都是产生意大利分离株基因多样性的因素。,18,2020/5/19,5IBV的鉴定和检测,目前对IBV进行检测和鉴定的方法很多，主要有血凝试验、血凝抑制试验、致病性试验、致鸡胚矮小化试验、RT-PCR鉴定、核酸探针技术、单克隆抗体技术等。徐雪、赵军等用鸡胚接种、反转录RT-PCR等方法对IBV河南流行毒株进行了S1基因的变异分析。Escutenaire等用实时定量RT-PCR对几种