中药生物技术复习（课堂PPT）

中药生物工程与技术课程复习,1,生物技术的定义,（1）是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器，将物料进行加工以提供产品来为社会服务的技术。（2）即生物工程，是指以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他学科的科学原理，按照预先的设计，改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需的产品或达到某种目的。,2,中药生物技术的含义,是以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他学科的科学原理，针对中药和天然药物及其活性成分研究、开发和生产中存在的具体问题，按照预先的设计，进行生物体改造或生物原料加工，使其符合中药现代化和产业化的一门科学技术。利用生物技术的基本研究思路和方法研究中药和天然药物及其活性成分。,3,中药生物技术的主要内容,基因工程发酵工程细胞工程蛋白质工程与酶工程抗体工程和组织工程,4,一、生物技术在高质量中药原料的研究和生产以及中药材资源的可持续利用中有巨大的应用潜力1.中药基因研究是中药资源保护、种植和可持续利用的重要手段建立珍稀濒危中药材的基因库；高抗性的转基因药用植物；选育优良品种；道地性药材遗传特征分析,中药生物技术发展概况,5,抗除草剂大豆,样品比较（左为普通棉花，右为兔毛转基因棉花）,6,2.细胞工程技术为中药和天然药物人工资源的开发提供了有效途径药物植物的快速繁殖、脱病毒大规模培养技术克隆技术，虎、穿山甲等,7,3.发酵工程技术为现代中药的生产提供了重要手段冬虫夏草菌发酵生产的菌丝体及产物紫杉醇：生物合成和生物转化技术,8,4.蛋白质工程和酶工程为中药和天然药物活性成分生产提供了最佳技术手段之一人参皂苷的转化,9,二、生物技术为提高中药和天然药物品质评价水平提供了新的实验方法基因鉴别技术为中药材品种鉴定提供了新手段,10,三、生物技术为中药和天然药物新药研究与开发提供了新的工具和途径1.生物芯片2.生物转化和生物组合化学,11,第一篇基因工程技术与中药研究,12,分子生物学基础知识,分子生物学是对生物大分子进行结构和功能研究的一门科学。主要是核酸生物学,13,核酸的种类DNA脱氧核糖核酸RNA核糖核酸,14,组成核酸链的单体,15,DNA和RNA链的形成,16,DNA和RNA链的区别,17,DNA的结构,一级结构二级结构三级结构,18,核苷酸的排列顺序,一,19,53方向的判断,20,BDNA、ADNA、ZDNA等,21,DNA双螺旋结构,22,23,DNA超螺旋结构,24,DNA的功能,DNA携带两类不同的遗传信息：一类是负责蛋白质氨基酸组成的信息；二类是相关基因选择性表达的信息,25,RNA的功能,rRNA是构成核糖体的骨架tRNA转动氨基酸mRNA蛋白质合成的模板种类非常多，每一种的含量非常低3端有poly(A)尾巴，5端有m7G帽子,26,DNA的生物学特性变性复性,27,DNA分子的变性,28,29,30,31,原核生物基因,32,原核生物基因特征,1.操纵子结构;2.蛋白质基因单拷贝;3.RNA基因多拷贝;4.结构基因是连续的,没内含子;5.大部分DNA用于编码蛋白质;6.重复序列少.,33,34,35,36,植物细胞中DNA的提取,一般步骤：（一）材料的预处理（二）提取（三）杂质的去除,37,提取,1.CTAB法原理可破坏细胞膜使DNA释放到缓冲液中；可保护DNA免受内源性核酸酶的降解；可与核酸形成复合物，在高盐溶液中可溶并且很稳定，降低盐的浓度可使之沉淀出来；用乙醇可将复合物分离开来，核酸沉淀下来，CTAB溶于乙醇中。,38,CTAB法提取步骤加入10%CTAB提取液进行提取离心分离复合物沉淀溶于高盐溶液中乙醇沉淀DNA,39,基因工程：指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的宿主细胞内，能持续稳定地繁殖和表达外源DNA。,40,41,42,基因工程的主要内容和步骤,获得目的基因；（切）构建重组DNA分子；（接）转化重组DNA分子；（转）扩增重组DNA分子；（增）筛选阳性重组克隆；（筛）提取扩增的目的基因；构建重组表达载体，转入宿主细胞，实现目的多肽或蛋白的表达。,分子克隆,43,基因工程常用工具酶,限制性内切酶（切）；DNA连接酶（接）；DNA聚合酶,44,限制性内切酶,是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基序列的核酸水解酶。通过切割DNA分子，对含有特定基因的片段进行分离、分析。常用的限制性内切酶为型限制性内切酶。,45,DNA连接酶,用于将两段乃至数段DNA拼接起来的酶称为DNA连接酶。它能催化5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键。T4DNA连接酶：来自T4噬菌体，作用底物必须是双链DNA，既可连接匹配的粘性末端，也可连接平末端，最常用。,46,DNA聚合酶,以DNA或RNA为模板，催化dNTP连续加到双链DNA引物链3-OH末端，合成与模板互补的DNA。TaqDNA聚合酶：DNA测序和PCR反应大肠杆菌DNA聚合酶（全酶）及其大片段（Klenow片段）,47,基因克隆载体,基因克隆载体：指在特定系统中能自我复制的DNA分子。所分离的外源DNA一般并不带有复制控制系统及在新的受体细胞中实现功能表达所需的调控系统。克隆载体：以繁殖DNA片断为目的的载体表达载体：用来将克隆的外源基因在寄主细胞内表达成蛋白质的载体,48,克隆载体,必备条件：复制原点；合适的限制性内切酶酶切位点；筛选标记；拷贝数多；易与寄主DNA分开,49,克隆载体,质粒载体：以细菌质粒（细菌细胞内一类独立于染色体而能自我复制的环状双螺旋小分子DNA）的各种元件为基础组建而成的基因工程载体。,50,质粒载体pBR322图谱,51,表达载体的必须元件：复制原点；合适的酶切位点；强的且能被寄主的RNA聚合酶识别的启动子；强的转录终止序列；所产生的mRNA要有AUG和S-D序列。,基因表达载体,52,表达载体,分胞内表达和分泌表达载体原核细胞表达载体和真核细胞表达载体融合型表达载体和非融合型表达载体,53,目的基因的获得,PCR方法自基因组文库中分离化学合成法限制酶法（鸟枪法）物理分离法,54,PCR方法,PolymeraseChainReaction基本原理：变性、退火、延伸,55,目的基因与载体的体外连接,粘末端DNA片断的连接平末端DNA片断的连接粘平末端DNA片段连接,56,重组基因转入受体细胞,将重组质粒DNA转入受体细胞称为转化。将重组分子引入宿主细胞的方式有：转化、转导、转染、杂交、细胞融合、脂质体介导转移、显微注射法、电穿孔法等,57,重组体的克隆与筛选,克隆：无性繁殖筛选方法：直接筛选和间接筛选1.遗传学直接筛选：利用可选择的遗传表型和功能进行筛选，如抗药性、营养缺陷型2.间接法：根据分子生物学特性遗传学直接筛选可靠性较差，可作为初筛；分子生物学的间接法可靠性强，可作为最后鉴定。,58,外源基因的高效表达和调控,外源基因表达是指利用被克隆入某一种载体的目的基因产生蛋白质的过程。表达过程包括转录、翻译、后加工等。每个步骤都是在各调节因子控制下完成的。原核基因在原核细胞中表达较易；真核基因可在真核细胞或原核细胞中表达,59,DNA分子标记,20世纪80年代以来发展起来的；由于同种生物具有相同的DNA序列，不同种生物具有不同的DNA序列，可以依据DNA序列的差异来鉴定生物物种。,60,遗传多样性与DNA多态性,DNA多态性是指染色体等位基因中核苷酸排列顺序的差异。等位基因：染色体同一位点处可决定某一遗传性状的几个基因；生物遗传多样性是DNA多态性的结果。DNA多态性是基因突变的结果。基因突变：A.有利突变B.中性突变C.不利突变,61,DNA分子标记技术,分子标记：指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。广义：可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质；狭义：DNA分子标记可分为三类：（1）基于分子杂交的分子标记技术；（2）基于PCR的分子标记；（3）DNA序列测定,62,DNA分子标记用于生药鉴定的优点,特异性强、稳定性好、微量、便捷、准确等特点；适合于近缘品种、易混淆品种、珍稀品种、动物药材、破碎药材、陈旧药材、腐烂药材及植物模式标本、中药出土标本、古化石标本等,63,RFLP技术,Restrictionfragmentlengthpolymorphism限制性内切酶切片段长度多态性；由于不同物种基因组内限制性酶切位点的不同造成酶切后DNA片段长度发生变化，限制性片段的长度在不同个体间呈多态性现象，即称为限制性片段长度多态性,64,65,DNA多态性产生的方式,基因点突变，造成原有切点消失或产生新的切点；结构重排：（1）缺失、倒位或插入等引起的DNA顺序的突变；（2）多个串联重复顺序组成的高变区，由于重复顺序的拷贝数不同造成限制性内切酶识别位点在基因组中的相对位置发生改变。,66,RFLP基本步骤,靶DNA的制备；核酸探针的标记杂交显示,67,第二篇发酵技术及其在中药研究中的应用,68,一.发酵与发酵工程,1.发酵早期：酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者指酒的生产过程。生化学：微生物在无氧条件下的分解各种有机物质产生能量的一种方式。现代发酵：利用微生物的生命活动来制造产品的过程。,69,2.发酵工程又称微生物工程，发酵技术，是将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机结合，利用微生物的代谢、转化功能，获得有用物质的工程技术。发酵工程是“研究利用微生物的工业，即微生物参与的工艺过程”。,70,三.发酵工程的内容和特点1.发酵工程的内容,发酵工程,上游工程,发酵工程,下游工程,菌种选育、最适发酵条件、培养基的筛选,培养基制备和灭菌，发酵罐、管路的灭菌，无菌空气的供给，种子培养，生产培养及控制，补料,产品的分离纯化,71,2.发酵工程的特点反应条件温和，设备简单；微生物生长繁殖迅速，发酵周期短；发酵原料来源广泛，价格低廉；反应以微生物的自动调控方式进行；易产生高分子化合物及对其转化；可对菌种进行改良；可大量生产新的活性物质。,72,四.微生物发酵类型1.微生物菌体发酵目的：获得微生物菌体细胞酵母和藻类、担子菌，苏云金芽杆菌、疫苗等特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长稳定期产量最高。,73,2.微生物酶发酵目的：获得酶制剂和酶调节剂青霉素酰化酶、糖苷酶抑制剂血管紧张素转化酶抑制剂氨肽酶抑制剂特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。,74,3.微生物代谢产物发酵,初级代谢产物：对数生长期形成的，细胞自身生长所必需的代谢产物。无种属特异性次级代谢产物：在稳定期所产生的自身生长非必需代谢产物。微量、特殊活性、明显种属特异性,75,4.微生物的生物转化,定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位(基团)的作用，使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物实质：利用微生物代谢过程中的某一酶或酶系将一种化合物转化成含有特殊功能基团产物的生物化学反应。二步发酵法生产维生素C,76,5.基因工程发酵6.动、植物细胞培养,77,五.发酵培养方法与过程,1.表面发酵培养固体表面发酵培养：投资小、设备少、简单易行、适于小型化生产2.液体深层发酵培养微生物细胞在液体深层中进行纯种培养的过程,78,3.液体深层发酵培养一般流程,79,六.菌种来源及选育1.发酵工业中常用的微生物（一）细菌(二)放线菌(三)酵母(四)霉菌,80,对于工业微生物发酵生产来说，决定其生产水平高低的最主要因素有三个：生产菌种发酵工艺提取工艺,最重要的,81,自然选育诱变育种,82,自然选育:利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离，筛选排除衰退型菌株，选择维持原有生产水平的菌株的纯种选育的方法。,83,菌种为何会退化和变异？,84,诱变育种：以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从变异体中找出产量高、性状优良的突变株，并找出其最佳培养基和最佳培养条件，使其在最适的环境条件下合成有效产物。,85,概念培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的，按一定比例配制的多种营养物质的混合物。,七.培养基的配制与灭菌,86,按成分不同划分,87,按物理状态不同划分,88,增殖培养基：可以配制成适合某种微生物生长而不适合其他微生物生长，从而达到从自然界分离这种微生物的目的。选择培养基：选择培养基是根据某种或某一类群微生物的特殊营养需要或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的一类培养基。利用这种培养基可以将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。（抑制）鉴别培养基：普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的指示剂或化学药品，从而产生某种明显的特征性变化，以区别不同的微生物。,按培养基的用途划分:,89,发酵生产中的培养基类型,工业发酵中培养基往往是依据生产流程和作用分为：斜面培养基种子培养基发酵培养基,90,（二）培养基的成分与作用碳源氮源水无机盐和微量元素前体消沫剂其他成分（生长因子、抑制剂、诱导物）,91,有机氮源花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体进一步分解代谢。,92,无机氮源铵盐、硝酸盐、氨水等，微生物对其吸收利用比有机物快，所以也称速效氮源。利用无机氮时应注意引起的pH变化。,93,（三）培养基的灭菌1.灭菌是指利用物理或化学的方法杀灭或除去物料及设备中一切有生命物质的过程。2.一般采用湿热灭菌的办法进行，条件为121度30分钟。3.其他见下表。,94,八.种子的扩大培养1.定义指将保藏的处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面进行活化，并逐级扩大培养以获得一定数量和质量的纯种的过程。,95,2.种子扩大培养流程,96,发酵过程的控制和优化,97,发酵过程的工艺参数控制,发酵控制是取得高产高质产品的必要条件发酵控制的先决条件是了解发酵进行的情况，进而做出相应的调整，使发酵过程有利于目的产物的积累和产品质量的提高参数：通过取样分析获得的有关发酵的信息,98,工艺参数,物理参数化学参数生物参数,99,物理参数,温度压力搅拌转速搅拌功率空气流量粘度,100,化学参数,pH基质浓度溶解氧浓度氧化还原电位产物浓度废气中氧的含量废气中CO2的含量,101,生物参数,菌体浓度菌丝形态,102,最适温度的选择,最适发酵温度是指既适合菌体的生长又适合代谢产物合成的温度菌体生长的最适温度和产物合成的最适温度往往是不一致的最适发酵温度随菌种、培养基成分、培养条件、菌体生长阶段而改变发酵温度的确定，从理论上讲整个发酵过程中不应只选一个培养温度,103,温度的控制,工业生产中，因发酵中释放了大量的发酵热，需要冷却的情况较多措施：在夹套或蛇管中通入冷水进行控制；气温较高，采用冷冻盐水进行循环式降温，可迅速达到恒温。,104,pH对发酵的影响,微生物菌体的生长、发育及代谢产物的合成，不仅需要合适的温度，还需要合适的pH值。适合微生物生长的pH和适合微生物合成产物的pH往往不同。适宜大多数微生物生长的pH值范围是36，最适pH的变化范围是0.51.0。,105,pH的控制,1.需要考虑和试验发酵培养基的基础配方，使它们有个适当的配比，使发酵过程中的pH变化在合适的范围内。在分批发酵中，常添加缓冲剂如CaCO3来控制pH。,106,2.在发酵过程中直接补加酸、碱或补料的方式来控制，特别是补料效果比较明显。现在常用的是以生理酸性物质像（NH4)2SO4或碱性物质氨水来控制。在加多了消沫油时，采用提高空气流量来加速脂肪酸的氧化，以提高pH。在氨基酸、抗生素等的发酵中，已经成功地采用了补料的方法来调节pH。,107,溶氧异常下降的原因有哪些？,污染好气性杂菌菌体代谢发生异常现象某些设备发生故障或工艺控制发生变化,108,溶氧异常升高的原因有哪些？,在供氧条件没发生变化的情况下，耗氧量的显著减少，会引起溶氧异常上升。特别注意：是否污染烈性噬菌体若污染了烈性噬菌体：产生菌尚未裂解，呼吸就受到抑制溶氧明显上升菌体破裂会完全失去呼吸能力溶氧直线上升,109,泡沫的控制,1.调整培养基的成分和改变某些发酵条件或改变发酵工艺来控制2.消除已形成的泡沫，可用机械消泡和消沫剂消泡,110,常用消沫剂,天然油脂类豆油、玉米油、棉籽油、菜籽油和猪油高碳醇、脂肪酸或酯类聚醚类GP、GPE硅酮类其中，以天然油脂类和聚醚类在微生物药物发酵中最为常用。,111,发酵液,预处理,细胞分离,细胞破碎,细胞碎片分离,初步纯化,高度纯化,成品加工,（加热、调pH、絮凝）,（过滤、离心分离、错流过滤）,（匀化、研磨）,（离心分离、错流过滤、两水相萃取）,（沉淀、吸附、离子交换、萃取、超滤）,（沉淀、超滤、色层分离、结晶）,（浓缩、无菌过滤、干燥）,发酵的下游处理,胞外产物,112,微生物发酵的操作方式,分批发酵补料分批发酵连续发酵,113,分批发酵,一次性投入料液不同代谢产物分批发酵的基本过程相同其特点是微生物所处的环境在发酵过程中不断地变化,114,115,连续发酵,发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。优点发酵周期长，得到高的产量，降低生产成本等。缺点菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。控制方式：恒浊器法和恒化器法实际应用还较少,116,补料分批发酵,Fed-batchculture,FBC是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜料液的培养方法。又称为半连续培养或半连续发酵一种控制发酵的好方法,117,补料对发酵的影响,可以控制抑制性底物的浓度有些基质是合成产物必需的前体物质同，浓度过高，就会影响菌体代谢，使产物产量下降；有些溶解度小，达不到应有的浓度而影响转化率，采用补料就可以解决底物抑制和浓度不够的问题。可以解除或减弱分解产物阻遏有些合成酶受到易利用的碳源或氮源的阻遏，通过补料来限制基质的浓度就可以解除这种作用。可以使发酵过程最佳化分批补料技术可使微生物保持在最大生产力状态。,118,固态发酵,119,一、固态发酵指使用不溶性固态基质来培养微生物的工艺过程。既包括将固体悬浮在液体中的深层发酵，也包括在没有或几乎没有游离水的湿固体材料上培养微生物的工艺过程。,120,实例：制曲酿酒腌制食品肥料堆积优点：条件相对粗放；培养基简单处理，投入小，利于规模化生产；产品好，利于生物循环。,121,二、固态发酵过程控制参数特征及策略（一）基质研究1.基质特性2.底物预处理3.培养基灭菌,122,（二）无菌操作无菌操作在固态发酵中不是十分重要。当然，操作尽可能无菌。（三）过程控制参数1.水活度2.通气与传质3.温度4.pH控制,123,三、药用真菌与固体发酵（一）早期的药用真菌与“制曲工艺”（二）近代的药用真菌与发酵生产（三）药用真菌新型固体发酵工程,124,发酵技术在中药生产中的应用,一、概述二、菌类中药的液体深层发酵生产三、中药的固体发酵生产四、药用植物的内生真菌,125,一、概述,发酵工程应用于中药生物技术研究主要集中在菌类中药的发酵生产和基因工程药物生产中。菌类中药历史悠久供药用的菌类主要是菌丝体发达的高等真菌。明代本草纲目收录了20余种；现代中药大辞典收录了27种；药典收录了常用的5种菌类中药。,126,常见的菌类中药冬虫夏草、茯苓、灵芝、马勃、银耳、雷丸活性成分多糖、氨基酸、生物碱、甾醇、抗生素等。,特别受到重视,127,二、菌类中药的液体深层发酵,一、虫草菌丝体的液体深层发酵生产二、灵芝菌丝体的发酵生产三、中药红曲的发酵生产,128,一、虫草菌丝体的液体深层发酵生产以中国专利CN85102231A公开的生产方法为例：,虫草菌斜面,摇瓶种子培养,种子罐扩大培养,发酵罐深层发酵,离心分离,发酵液,菌丝体,无菌空气,灭菌的营养物,129,二、灵芝菌丝体的发酵生产传统上灵芝是通过野外采集或人工栽培获得，以子实体或孢子入药。灵芝深层培养液经测定有十分丰富的营养物质和药用价值，深层发酵法获得的菌丝体及培养液加工提取可制成添加剂和医疗保健食品。其中，发酵法获得的灵芝多糖是目前的热点。,130,（二）灵芝液体深层发酵生产工艺,灵芝斜面菌种,级摇瓶菌种,级摇瓶菌种,发酵罐深层发酵,发酵液粗滤,菌丝体,发酵液,原料前处理,配料,灭菌,冷却,空压机,总过滤器,分过滤器,131,三、中药的固体发酵,（一）几个概念菌质：真菌固体发酵所生长的大量菌丝体与发酵后的基质组成的混合物。药用菌质：药用真菌于营养基质上固体发酵所生产的菌质。新型固体发酵工程：药用真菌在由中药材组成的药性基质上进行的固体发酵。药性菌质：采用由中药材组成的药性基质所产的菌质，是人工制造的新药材，产品应属中药一类新药。,132,四、药用植物的内生真菌,（一）内生真菌的涵义1.内生真菌：是指其生活史的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的真菌。包括在其生活史中的某一阶段营表生的腐生真菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原真菌和菌根真菌。2.植物和内生真菌的关系：互惠共生,133,（二）内生真菌的生物多样性内生真菌主要分布在植物的叶鞘和种子中。据内生真菌与宿主专一性分析，平均每种寄主有4-5种寄生菌种类至少有107种（三）内生真菌产生活性代谢产物的特点：产生与宿主相同或相似的化学物质促进宿主某些代谢产物的形成和生长研究的意义？,134,(四)目前分离到的产生物活性物质的内生真菌：1.抗癌：红豆杉内生真菌紫杉醇类长春花的内生真菌长春新碱桃七儿内生真菌鬼臼毒素2.免疫抑制：雷公藤雷公藤甲素,雷公藤,135,（五）药用动植物内生真菌发酵生产活性化合物的优点1.持续的生产2.利于工业化3.微生物的培养技术简单，容易提高产量4.可通过基因工程等方法筛选高产菌株5.生长迅速，易培养,136,植物细胞工程技术及其在中药研究中的应用,137,第三篇植物细胞工程技术及其在中药研究中的应用,138,细胞工程：应用细胞生物学和分子生物学的方法，借助工程学的试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。广义上：生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术；狭义上：细胞融合和细胞培养技术。,139,植物细胞工程的研究内容包括：植物组织、器官培养技术；细胞培养技术；原生质体融合与培养；亚细胞水平的操作技术等。上游工程：细胞培养、遗传操作和保藏下游工程：生产实践中用以生产生物产品,140,植物细胞的全能性：是指植物体中任何一个具有完整细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个体。植物组织和器官培养：在无菌和人工控制条件（培养基、光照、温度等）下，研究植物的细胞、组织和器官的生长发育以及控制技术。植物的分化：植物细胞通过分裂产生结构和功能上的稳定性差异的过程。分为胚胎发生、器官发生两个阶段。,141,脱分化：已经分化的细胞、组织和器官在人工培养的条件下变成未分化的细胞和组织的过程。再分化：通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的条件下再分化成为胚状体或直接分化出器官的过程。胚状体:对应于胚（embryo），在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端）,功能与胚相同的结构。外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。,142,愈伤组织：外植体经脱分化所形成的排列疏松而无规则、形态无定形的薄壁细胞聚集体。细胞培养：利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化的各种试验。无性繁殖系：又叫克隆，使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同一外值体而获得越来越多的无性繁殖后代，如根无性系、组织无性系、悬浮培养物无性系等。继代培养:由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代时间而称之为“第一代培养”。连续多代的培养即为“继代培养”。,143,生理活性物质：一类对细胞内的生化反应和生理活动起调节作用的物质的总称。后含物：是植物细胞在代谢过程中产生的储藏物质或废弃物质。,144,植物培养细胞的生理特性：1.植物培养细胞重量的增加主要是取决于对数期，而次级代谢产物的累积则主要在稳定期完成；2.多以非均相集合体的细胞团形式存在；3.抗张力强度大，抗剪切能力小；4.培养过程要不断的供氧气，但所需的溶氧水平较低；5.泡沫问题没有微生物培养时的严重。,145,药用植物细胞培养及次生代谢产物生产,植物细胞培养的基本技术影响植物次级代谢产物累积的因素药用植物细胞悬浮培养与毛状根培养植物细胞培养的生物反应器（了解）,146,第一节植物细胞培养的基本技术,一、植物材料的准备外植体：无杂菌材料。需用表面灭菌剂进行除菌。最常用的灭菌剂是次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞。,147,二、培养方法原生质体培养单倍体细胞培养固体培养液体培养悬浮细胞培养固定化细胞培养,培养对象,培养基,培养方式,148,固体培养的优缺点：优点：简便易行，培养所占空间小；缺点：1.仅有一部分接触面，生长不平衡2.气体交换不畅，有害物质难排出3.极化现象，细胞群体不均匀4.测生理生化指标麻烦,149,外植体在培养三周左右必须移换至新鲜培养基上，以保持培养物的继续正常生长。移换一次培养基称一次继代培养。一种外植体经过一定次数的继代培养，其培养物就可用于悬浮培养。多次继代培养，愈伤组织变得较为疏松时方宜进行悬浮培养。,150,植物细胞大规模培养系统（一）成批培养法将培养基一次性地加入反应器，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式。两步培养法：即用两个生物反应器，第一个反应器用于细胞生物量的累积，第二个反应器用于次级代谢产物的生产。（二）半连续培养法（三）连续培养法,151,第二节影响植物次级代谢产物累积的因素一、外植体的选择不同外植体的悬浮细胞培养物，基最大次级代谢产物的累积时间各不相同。延迟期、加速期、稳定期、与细胞生长同步,152,植物次生产物种类繁多（据保守估计已超过2万种）植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工等领域有重要意义来自于植物体和细胞培养的紫草宁含量比较生产方式生产周期紫草宁含量（干重）完整植株23年12植物细胞培养3周14植物次生代谢产品的市场潜能产品成分用途年销售额（亿美元）长春花碱治疗白血病1820（美国）阿吗灵循环系统障碍药525（全世界）奎宁治疗疟疾510（美国）致热素杀虫剂20（全世界）毛地黄心脏病药2055（美国）,153,二、培养条件（一）培养环境的内在因素1.接种和诱导；2.基本培养基元素组成（氮、磷、铜等）；3.碳源4.植物生长调节剂：起关键性作用5.氧气和pH6.渗出物,154,（二）两步培养法即第一步使用适合细胞生长的培养基，称为“生长培养基”，第二步使用适于次级代谢产物合成的培养基，称为“生产培养基”。生长培养基的特点：实现细胞的高生产率生产培养基的特点：通常具有较低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖分或较少的碳源,155,（三）诱导子植物抗毒素：植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物。诱导子：触发形成抗毒素信号的物质。生物诱导子：植物体在防御过程中为对抗微生物感染而产生的物质，主要包括分生孢子、降解细胞壁的酶类、细胞壁碎片、有机体产生的代谢物等成分。非生物诱导子：不是植物细胞中天然成分但又能触发植物细胞形成抗毒素信号的物质。,156,（四）培养环境的外部因素1.温度：20-28度。2.搅拌频率。3.培养容器的影响。4.光的影响,157,第三节药用植物细胞悬浮培养与毛状根培养体外培养方法生产有价值的天然产物具有的优点：1.在人工控制条件下进行，可得到超整株植物产量的代谢产物；2.无菌条件，可排除病菌和虫害侵扰；3.特定的生物转化反应；4.可探索新的合成路线,158,药用植物组织培养进行天然活性成分的生产多采用1.悬浮培养细胞2.Ri质粒转化的毛状根,159,一、药用植物细胞悬浮培养悬浮培养细胞是将植物细胞和小的细胞聚集体悬浮在液体培养基上进行培养，在培养过程中必须保持较好的分散状态。（一）细胞培养物的制备1.从外植体直接产生2.通过愈伤组织产生：最常用。植物生长调节物质：生长素IAA、NAA、2,4-D,分裂素KT、6-BA。,160,通过愈伤组织诱导产生悬浮细胞（如红豆杉产taxol）,植物细胞悬浮培养,161,（二）高产细胞株的筛选（三）悬浮培养细胞培养条件的优化,162,二、药用植物毛状根培养药用植物毛状根的培养涉及到植物转基因技术和植物组织培养技术。（一）毛状根的产生机理毛状根是由于发根农杆菌携带的Ri质粒侵染植物而产生的。发根农杆菌是根瘤菌科农杆菌属一类革兰氏阴性土壤农杆菌，可以侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物，甚至是裸子植物而诱发植物产生毛状根。,163,什么是毛转根（发根）？,发根（hairyroot）是发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes)感染整体植株或其某一器官、组织、单个细胞甚至原生质体后，其Ri质粒上的TDNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型（形成多分枝的、生长迅速的不定根）,二）药用植物毛转根培养,164,法国苦苣的毛转根,二）药用植物毛转根培养,165,166,毛状根产生次生代谢产物的特点,激素自养生长迅速遗传和生化性状稳定合成次生代谢产物能力强,二）药用植物毛转根培养,167,植物细胞工程药用植物原生质体的制备、融合、培养植物微繁殖技术植物脱毒技术,168,一原生质体概述,（一）概念原生质体：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。亚原生质体：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。核质体：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体。胞质体：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。,169,（三）原生质体的优点：可融合性良好受体系统,170,原生质体的分离,外植体的选择质壁分离酶解原生质体的分离活力检测原生质体的融合,171,第二节原生质体的培养,一、培养基1渗透压常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗。2无机盐大量元素浓度；NO3和NH4+的比例（前高后低）；Ca2+浓度,172,3有机成分维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。4激素常用的激素：NAA、IAA、BA与2,4-D5pH值,173,二、原生质体培养方法（一）固体培养（二）液体培养法（三）液固培养法双层培养法：即在培养皿底部先铺一薄层含或不含原生质体或细胞的固体培养基，再在其上进行原生质体的液体浅层培养。,174,三、原生质体的发育和植株再生细胞壁再生细胞分裂愈伤组织形成器官形成和完整植株再生,175,第三节原生质体的融合,根据融合时细胞的完整程度，可分为两大类：对称融合（asymmetricfusion），即两个完整的细胞原生质体融合。对称细胞杂种非对称融合（symmetricfusion）利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合,176,原生质体融合的方法,1PEG诱导融合法PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。PEG的作用机理：Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。,177,2电融合法与PEG融合相比，电融合有三大优点：一是不存在对细胞的毒害问题；二是融合效率高；三是融合技术操作简便。电融合仪的结构特点：交变电场部分；高频直流电击部分。,178,融合细胞的形成,179,二、原生质体的融合产物：对称细胞杂种：含有来自双亲的全部染色体组成。不对称细胞杂种：有一个融合亲本的染色体组成发生单向丢失或部分丢失。,180,植物微繁殖技术,植物微繁殖：利用组织培养技术进行植物的快速无性繁殖的方法，也叫“快速繁殖技术”。块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物，每年相当一部分产品要用留作种。如：大蒜：留种量占产量的五到八分之一。马铃薯：留种量占产量的十分之一。贝母：留种量占产量的三分之一。,181,意义：能够有效地保持优良品种的特性；生产无病毒种苗，防止品种退化；快速繁殖新品种，使优良品种迅速应用；节约耕地，提高农产品的商品率；便于运输。,182,植物微繁殖的一般技术,建立无菌培养物芽的增殖诱导生根试管苗的移植,183,五植物脱毒技术,地黄病毒病、曼陀罗花叶病等数10种植物病毒的危害？减产30%以上无有效的防治措施脱毒苗,184,五植物脱毒技术,脱毒的方法：物理和化学方法:茎尖和愈伤组织高温和低温处理/化学试剂热处理病毒（温热疗法）原理组织培养的方法：茎尖/愈伤组织/花粉或花药培养/珠心胚培养,185,茎尖培养脱毒,主要因素：茎尖大小特点：脱毒率高、脱毒速度快、但存活率低改进措施：热处理和茎尖培养相结合,186,第三篇生物转化技术及其在中药研究中的应用,187,基本概念利用酶或有机体作为催化剂实现化学转化的过程，也称生物催化。（国际刊物）生物转化的特点：（酶催化的特点）类型多选择性条件温和步骤少,188,氧化反应还原反应水解反应酰基化反应降解反应脱水反应缩合反应胺化反应糖基化,189,以下生物转化反应中属于氧化反应的为：()A.R-CH2OHR-CHOB.RCH2CH2-CH3RC=CHCH3C.R-CHORCH2OHD.R1-